Mikroprzepływowa mikroskopia poklatkowa do badania trwałości antybiotyków w bakteriach

Zacznij od wykładniczo rosnących komórek bakteryjnych eksprymujących fluorescencyjnie znakowane białko fuzyjne wiążące DNA, aby uwidocznić nukleoid.

Dodaj komórki do wlotów komórek wstępnie przygotowanej płytki mikroprzepływowej.

Następnie wprowadzić pożywki zawierające antybiotyki i pożywki wolne od antybiotyków do oddzielnych wlotów roztworu.

Uszczelnij płytkę, zamontuj ją na stoliku mikroskopu i rozpocznij obrazowanie poklatkowe.

Najpierw załaduj komórki do komory hodowlanej.

Następnie perfunduj pożywkę wolną od antybiotyków do komory, aby wspomóc wykładniczy wzrost komórek.

Na koniec wprowadź pożywkę zawierającą antybiotyki.

Antybiotyk indukuje pęknięcia dwuniciowego DNA, zabijając wrażliwe komórki. Komórki te wykazują zagęszczone, niereplikujące się nukleoidy o stabilnej fluorescencji.

Przełącz się z powrotem na pożywki wolne od antybiotyków, aby przyspieszyć powrót do zdrowia.

Stałe komórki - mała subpopulacja, która przeżywa leczenie antybiotykami - wznawiają replikację DNA, wydłużają się i dzielą.

To odzyskiwanie prowadzi do zwiększonej fluorescencji w komórkach trwałych, co pozwala na wizualne odróżnienie ich od komórek podatnych.

Usuń roztwór konserwujący z każdej studzienki płytki mikroprzepływowej i zastąp go świeżą pożywką hodowlaną. Uszczelnij płytkę mikroprzepływową z układem kolektora, klikając przycisk Seal lub za pomocą oprogramowania mikroprzepływowego.

Następnie, w interfejsie oprogramowania mikroprzepływowego, wykonaj pierwszą sekwencję zalewania, klikając Uruchom sekwencję zalewania cieczy. Inkubować płytkę w termostatycznie sterowanej komorze mikroskopu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny przed rozpoczęciem obrazowania mikroskopowego. Następnie rozpocznij drugą sekwencję zalewania cieczą przed rozpoczęciem eksperymentu.

Uszczelnij płytkę mikroprzepływową, klikając przycisk Unseal Plate (Rozpieczętuj płytkę) w interfejsie oprogramowania mikroprzepływowego. Zastąp pożywkę w studzienkach 200 mikrolitrami świeżej pożywki, świeżej pożywki zawierającej antybiotyk i próbką kultury rozcieńczoną 0,01 OD w świeżej pożywce. Po uszczelnieniu płytki mikroprzepływowej, jak pokazano wcześniej, umieść płytkę na obiektywie mikroskopu wewnątrz szafki mikroskopu.

W oprogramowaniu mikroprzepływowym kliknij przycisk Uruchom sekwencję ładowania komórek, aby umożliwić załadowanie komórek do płytki mikroprzepływowej. Ustaw optymalną ostrość w trybie światła przechodzącego i wybierz kilka obszarów zainteresowania, w których można zaobserwować odpowiednią liczbę komórek do 300 komórek na pole. W oprogramowaniu mikroprzepływowym edytuj Uruchom niestandardową sekwencję, aby zaprogramować wstrzykiwanie świeżej pożywki o stężeniu 6,9 kilopaskali przez sześć godzin do dołka pierwszego i drugiego, następnie pożywki zawierającej antybiotyk o stężeniu 6,9 kilopaskali przez sześć godzin do studzienki trzeciej, a na końcu świeżej pożywki o stężeniu 6,9 kilopaskali przez 24 godziny do studzienek czwartej i piątej.

Wykonaj obrazowanie mikroskopowe w trybie poklatkowym z jedną klatką co 15 minut przy użyciu światła przechodzącego i źródła światła wzbudzającego dla reportera fluorescencyjnego i uruchom program mikroprzepływowy. Otwórz oprogramowanie ImageJ lub Fiji na komputerze i przeciągnij obrazy z mikroskopii poklatkowej hyperstack na pasek ładowania Fiji. Użyj opcji Obraz, a następnie Kolor, a następnie Utwórz kompozyt, aby połączyć różne kanały hyperstack.

Użyj opcji Obraz, Kolor, a następnie Rozmieść kanały, jeśli kanały nie odpowiadają żądanemu kolorowi. Otwórz wtyczkę MicrobeJ i wykryj komórki bakteryjne za pomocą interfejsu edycji ręcznej. Usuń automatycznie wykryte komórki i ręcznie obrysuj interesujące komórki trwałe klatka po klatce.

Po wykryciu użyj ikony Wynik w interfejsie ręcznej edycji MicrobeJ, aby wygenerować tabelę ResultJ. Użyj tabeli ResultJ, aby uzyskać wgląd w różne parametry interesujące analizę jednokomórkową i zapisać plik ResultJ.