JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:48 min. • October 30th, 2025
Mukowiscydoza (CF) jest chorobą genetyczną, która powoduje gromadzenie się gęstego, lepkiego śluzu w płucach, tworząc plwocinę, która wspomaga rozwój drobnoustrojów chorobotwórczych.
Aby przygotować sztuczną plwocinę CF, weź roztwory o kluczowych właściwościach biochemicznych.
Mieszanina mucyny zawiera mucyny, które są glikoproteinami o dużej masie cząsteczkowej, które replikują lepkość plwociny CF i sprzyjają adhezji drobnoustrojów.
Mieszanka chemiczna dostarcza jony i glukozę, które wspomagają metabolizm mikrobiologiczny.
Mieszanka biologiczna dostarcza składników odżywczych do rozwoju drobnoustrojów.
Połącz wszystko, aby utworzyć sztuczną pożywkę z plwociny (ASM).
Dodaj środek buforowy, aby utrzymać łagodnie kwaśne pH, które sprzyja przetrwaniu patogenu.
W celu sterylizacji na pożywce przenieś ASM do próżniowej komory filtracyjnej z filtrem membranowym.
Filtruj pod wpływem mieszania, aby uniknąć agregacji mucyny i zapobiec zatkaniu filtra.
Próżnia zasysa medium przez filtr, usuwając zanieczyszczenia mikrobiologiczne i agregaty wielkocząsteczkowe.
ASM jest gotowy do hodowli drobnoustrojów związanych z mukowiscydozą.
Przygotować sztuczną pożywkę z plwociny, dodając 250 mililitrów ASCM do 1-litrowej butelki zawierającej ASMM. Następnie dodaj 250 mililitrów ASBM do pożywki butelki. Miareczkować pożywkę podstawowym 1 molowym buforem MOPS, aby osiągnąć pH 6,3 na bibułce pH.
Sztuczną pożywkę z plwociną przechowywać w lodówce w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu filtracji. Następnie, aby rozpocząć proces filtracji, przenieś 200 mililitrów niefiltrowanej sztucznej pożywki z plwociny do systemu filtracji próżniowej z filtrem o wielkości porów 0,22 mikrometra. Po podłączeniu systemu filtracji do pompy próżniowej włącz pompę próżniową. Następnie umieść komorę na wytrząsarce orbitalnej, wstrząsającej z prędkością 90 obrotów na minutę w zimnym pomieszczeniu w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Wymień filtr po przefiltrowaniu 350 mililitrów medium, aby rozwiązać problem zatykania. Po przefiltrowaniu znacznej ilości dodaj dodatkowe 150 mililitrów pożywki do filtracji. Powtarzaj filtrację z dodatkowymi komorami, aż wszystkie media zostaną przefiltrowane.