Kwantyfikacja jednostek tworzących kolonie bakterii związanych z jelitami u much Drosophila

Zacznij od mikropłytki zawierającej homogenaty przygotowane z much Drosophila . Muchy te miały kontrolowaną populację określonej bakterii w jelitach.

Homogenaty zawierają lizowane tkanki much i uwolnione bakterie jelitowe.

Odessać zawieszone bakterie i seryjnie rozcieńczyć na wielu mikropłytkach.

Małe objętości z każdego rozcieńczenia należy rozprowadzić na płytkach agarowych, upewniając się, że kropelki pozostają oddzielone.

Inkubuj, aby bakterie mogły namnażać się w widoczne kolonie.

Uchwyć obrazy płytek, aby określić ilościowo jednostki tworzące kolonie (CFU), które reprezentują liczbę żywotnych komórek bakteryjnych zdolnych do tworzenia pojedynczych kolonii.

Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, wyrównaj każdy obraz za pomocą linii odniesienia, zdefiniuj granicę i zastosuj jednolitą siatkę, aby podzielić go na strefy zliczania, z których każda odpowiada jednemu punktowi.

Dostosuj próg jasności, aby odróżnić poszczególne kolonie od tła, a następnie uruchom analizę, aby policzyć kolonie w każdym miejscu i określić ilościowo CFU.

Umieść trzy prostokątne płytki do wzrostu agaru MRS z otwartymi pokrywkami w komorze bezpieczeństwa biologicznego do wyschnięcia przez co najmniej 10 minut. Przygotować dwie płytki rozcieńczające, dodając 100 mikrolitrów PBS do każdego dołka sterylnej 96-dołkowej płytki za pomocą 96-kanałowego pipetera. Załaduj stojak z końcówkami P-20 do 96-kanałowego pipetera.

Wykonać rozcieńczenie w stosunku 1:10 przez zasysanie 11,1 mikrolitra homogenatu z płytki do pobierania próbek. Teraz dozuj go do pierwszej płytki rozcieńczającej zawierającej 100 mikrolitrów sterylnego PBS na studzienkę. Trzymać płytkę rozcieńczającą na wytrząsarce płytowej przez 10 sekund z prędkością 600 obr./min.

Wymieszać ponownie, pipetując w górę i w dół co najmniej 10 razy. Przenieść 11,1 mikrolitra z pierwszej płytki rozcieńczającej na drugą płytkę rozcieńczającą i powtórzyć etapy mieszania w celu uzyskania dalszych rozcieńczeń. W przypadku płytek punktowych załaduj dwa mikrolitry z każdej studzienki do 96-kanałowego pipetera.

Powoli opuść głowicę pipetera na płytkę, unikając wbijania się w agar, i upewnij się, że wszystkie plamki zostały dozowane. Następnie sprawdź, czy plamy płynu szybko wsiąkają w agar i nie spływają razem. Powtórzyć proces powlekania pozostałych płytek rozcieńczających zgodnie z opisem w manuskrypcie.

Gdy płyn zostanie całkowicie wchłonięty przez agar, odwróć płytki i inkubuj je, aż kolonie osiągną optymalną wielkość. Uporządkuj tablice logicznie i utrzymuj je w określonej kolejności podczas fotografowania. Ustaw je tak, aby A1 znajdował się w lewym górnym rogu dla wszystkich tablic.

Po zdjęciu pokrywy płyty umieść płytkę na stoliku tak, aby A1 był ustawiony we właściwym rogu. Wyobraź sobie płyty. Przenieś obrazy do komputera i zmień ich nazwy, w tym nazwę eksperymentu, typ nośnika, współczynnik rozcieńczenia i inne istotne szczegóły.

Uporządkuj obrazy do przetworzenia w celu oceny ilościowej w folderze. Nazwy plików, które odróżniają tablice, stają się tytułami kolumn dla każdego zestawu zliczeń w wyjściowym arkuszu kalkulacyjnym. Utwórz w folderze podfoldery o nazwach Przycięte i Paragony.

Te foldery otrzymają pliki wyjściowe. Teraz uruchom wtyczkę Croptacular z ImageJ i kliknij OK, aby rozpocząć przycinanie. Pojawi się okno dialogowe wyboru folderu źródłowego.

Kliknij przycisk OK. Wybierz folder źródłowy i kliknij przycisk Otwórz. Następnie kliknij OK w oknie dialogowym, aby wybrać katalog docelowy. Wybierz folder docelowy i naciśnij Otwórz.

Jeśli obraz jest już prosty, po prostu naciśnij spację. W przeciwnym razie wyprostuj obraz, rysując linię wzdłuż krawędzi, która powinna stać się pozioma. Przerysuj linię tyle razy, ile to konieczne, jeśli obraz nie wydaje się prosty.

Następnie narysuj ramkę graniczną obszaru zliczania i dostosuj jego rozmiar i proporcje, aż wszystkie miejsca znajdą się w swoich komórkach. Przeciągnij kursor poza obwiednię, aby odświeżyć siatkę. Gdy siatka wygląda dobrze, naciśnij Spacja.

Ponieważ wtyczka zakłada, że wszystkie zdjęcia są wyrównane identycznie, upewnij się, że następny obraz automatycznie obraca się pod tym samym kątem, co pierwszy. Jeśli to prawda, naciśnij spację, aby kontynuować. W przeciwnym razie wyprostuj obraz jak poprzednio.

Siatka również przywołuje to samo położenie, co na poprzednim obrazie. W razie potrzeby wyreguluj i naciśnij Spacja. Uruchom Count-On-It i wybierz Gridiron.

Ustaw próg intensywności kolonii na podstawie górnej i dolnej wartości intensywności piksela. Ustaw próg tak rygorystycznie, jak to możliwe, jednocześnie wybierając wszystkie kolonie. Kliknij przycisk OK w oknie dialogowym Wymagane działanie, gdy próg jest zadowalający, a następnie kliknij przycisk OK, aby kontynuować.

Na pierwszym obrazie dostępna jest opcja kontynuowania lub powrotu do menu ustawień. Aby kontynuować proces wsadowy, kliknij przycisk OK. Następnie wybierz folder, w którym chcesz przechowywać tabelę paragonów i wyników. Użyj utworzonego wcześniej folderu Paragony.

Po pierwszym obrazie kolejne obrazy będą domyślnie ustawione na ten sam próg, co poprzednie ustawienia. Kliknij przycisk OK, aby użyć tych ustawień lub je dostosować.