Wykrywanie powierzchniowych transporterów metali w Neisseria gonorrhoeae za pomocą Dot Blot

Zacznij od kultury Neisseria gonorrhoeae wyhodowanej na podłożu zubożonym w metale.

Niedobór metalu wyzwala ekspresję transporterów błony zewnętrznej, które inicjują wychwyt metalu, gdy jest dostępny.

Umieść wstępnie nasączoną membranę nitrocelulozową na wilgotnej bibule filtracyjnej i zmontuj aparat do ilosów.

Znajdź komórki bakteryjne i pozwól płynowi się wchłonąć.

Zdemontuj urządzenie, usuń membranę i wysusz je na powietrzu.

Dodaj agenta blokującego, aby zapobiec niespecyficznemu powiązaniu.

Ponownie włóż membranę do aparatu, uszczelnij ją parafilmem i ponownie zmontuj.

Dodać ligand wiążący metal pochodzący od gospodarza i inkubować z wytrząsaniem.

Ligand wiąże się z transporterami bakteryjnymi.

Usuń płyn i umyj membranę, aby usunąć wszelkie niezwiązane ligandy.

Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe specyficzne dla liganda, a następnie przeciwciało drugorzędowe sprzężone z enzymem i odczynnik do wykrywania kolorymetrycznego, który tworzy kolorowy produkt.

Widoczny sygnał wskazuje na ekspresję bakteryjnych transporterów metali w warunkach ograniczonych do zawartości metalu.

Po masowej podwójnej inkubacji należy ponownie rozcieńczyć kultury trzema objętościami CDM. Następnie inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza, potrząsając przez cztery godziny. Na krótko przed upływem czterech godzin wytnij trzy kawałki bibuły filtracyjnej i kawałek nitrocelulozy do przybliżonego rozmiaru potrzebnego do zmieszczenia się w aparacie dot-blot.

Namocz nitrocelulozę w wodzie dejonizowanej przez około 10 minut przed złożeniem aparatu z bibułą filtracyjną poniżej nitrocelulozy. Pod koniec inkubacji należy zapisać gęstość komórek i ujednolicić ją do odpowiedniej gęstości końcowej. Następnie pipetować kultury komórkowe na nitrocelulozę.

Gdy bibuła filtracyjna wchłonie całą ciecz, zdemontuj aparat i pozwól blotowi wyschnąć. Zablokuj membranę nitrocelulozową na jedną godzinę odpowiednim roztworem blokującym i ponownie zmontuj aparat dot-blot, zastępując bibułę filtracyjną folią parafinową, aby stworzyć szczelne uszczelnienie pod nitrocelulozą. Rozcieńczyć interesujący ligand wiążący metal do 0,2 mikromola w blokerze i sondować komórki przez godzinę z umiarkowanym wstrząsaniem.

Pod koniec inkubacji odsysaj płyn za pomocą próżni, umyj plamę i postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami immunologicznymi, aby rozwinąć sygnał.