Wykrywanie powierzchniowych transporterów metali w Neisseria gonorrhoeae za pomocą Dot Blot

Zacznij od kultury Neisseria gonorrhoeae wyhodowanej na podłożu zubożonym w metale.

Niedobór metalu wyzwala ekspresję transporterów błony zewnętrznej, które inicjują wychwyt metalu, gdy jest dostępny.

Umieść wstępnie nasączoną membranę nitrocelulozową na wilgotnej bibule filtracyjnej i zmontuj aparat do ilosów.

Znajdź komórki bakteryjne i pozwól płynowi się wchłonąć.

Zdemontuj urządzenie, usuń membranę i wysusz je na powietrzu.

Dodaj agenta blokującego, aby zapobiec niespecyficznemu powiązaniu.

Ponownie włóż membranę do aparatu, uszczelnij ją parafilmem i ponownie zmontuj.

Dodać ligand wiążący metal pochodzący od gospodarza i inkubować z wytrząsaniem.

Ligand wiąże się z transporterami bakteryjnymi.

Usuń płyn i umyj membranę, aby usunąć wszelkie niezwiązane ligandy.

Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe specyficzne dla liganda, a następnie przeciwciało drugorzędowe sprzężone z enzymem i odczynnik do wykrywania kolorymetrycznego, który tworzy kolorowy produkt.

Widoczny sygnał wskazuje na ekspresję bakteryjnych transporterów metali w warunkach ograniczonych do zawartości metalu.

Po masowej podwójnej inkubacji należy ponownie rozcieńczyć kultury trzema objętościami CDM. Następnie inkubuj kultury w te