Pomiar wskaźników błędnej translacji Mycobacterium smegmatis za pomocą systemu reporterowego GFP/lucyferazy

Weźmy na przykład kulturę Mycobacterium smegmatis zawierającą indukowalne geny GFP i znakowaną sygnałem wydzielania zmutowaną lucyferazę.

Zmutowany gen koduje nieaktywną lucyferazy, ale naturalna błędna translacja podczas syntezy białek wytwarza aktywny enzym.

GFP służy jako wewnętrzna kontrola w celu normalizacji ekspresji lucyferazy.

Dodaj induktor, aby zainicjować ekspresję genu, a następnie podwielokrotnić kulturę na płytkę wielodołkową.

Wprowadzić rosnące stężenia badanej cząsteczki do wybranych studzienek. Inkubować.

W warunkach kontrolnych błędna translacja powoduje aktywne wydzielanie lucyferazy.

Jeśli badana cząsteczka hamuje błędną translację, aktywne wydzielanie lucyferazy zmniejsza się.

Przenieś podwielokrotności hodowli na czarną płytkę i zmierz fluorescencję GFP.

Odwirować do granulowania komórek.

Przenieś supernatanty zawierające wydzielaną lucyferazy i dodaj substrat, gdzie aktywna lucyferazy katalizuje jej utlenianie, wytwarzając luminescencję.

Zmierz luminescencję i oblicz stosunek lucyferazy do GFP; Niższy współczynnik wskazuje na mniejsze błędy translacji spowodowane badaną cząsteczką.

Na początek zaszczepij dwa mililitry pożywki 7H9 bakteryjnym szczepem reporterowym.

Wstrząsaj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni lub do momentu, gdy OD o długości 600 nanometrów osiągnie fazę stacjonarną.

Następnie subkulturuj w 50 mililitrach pożywki 7H9 i hoduj, aż OD przy 600 nanometrach osiągnie późną fazę stacjonarną. Przed przeniesieniem bakterii na 96-dołkową płytkę dodaj ATC o końcowym stężeniu 50 nanogramów na mililitr i dobrze wymieszaj.

Dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę do klarownej, okrągłodennej 96-dołkowej płytki. Następnie dodaj różne dawki Ksg do wybranych studzienek, aby przebadać jego wpływ na wskaźniki błędnej translacji. Dodaj 200 mikrolitrów sterylnej wody do dołków brzegowych płytki, aby ograniczyć parowanie z dołków na próbki.

Szczelnie zamknąć płytkę, wstrząsnąć i indukować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 do 20 godzin. Użyj pipety wielokanałowej, aby pobrać 80 mikrolitrów z każdej studzienki. Przenieść próbki na 96-dołkową płytkę z czarnym dnem i zmierzyć sygnał GFP za pomocą luminometru.

Po zmierzeniu sygnału GFP odwirować płytkę z prędkością 3 220 razy g przez 10 minut. Następnie przenieś 50 mikrolitrów supernatantu na 96-dołkową płytkę z białym dnem.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów substratu Nluc do każdej studzienki, dobrze wymieszaj i zmierz luminescencję za pomocą luminometru. Na koniec określ stosunek Nluc/GFP, dzieląc skorygowaną wartość luminescencji Nluc przez fluorescencję GFP.