Pomiar wskaźników błędnej translacji Mycobacterium smegmatis za pomocą systemu reporterowego GFP/lucyferazy
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:38 min. • October 30th, 2025
Weźmy na przykład kulturę Mycobacterium smegmatis zawierającą indukowalne geny GFP i znakowaną sygnałem wydzielania zmutowaną lucyferazę.
Zmutowany gen koduje nieaktywną lucyferazy, ale naturalna błędna translacja podczas syntezy białek wytwarza aktywny enzym.
GFP służy jako wewnętrzna kontrola w celu normalizacji ekspresji lucyferazy.
Dodaj induktor, aby zainicjować ekspresję genu, a następnie podwielokrotnić kulturę na płytkę wielodołkową.
Wprowadzić rosnące stężenia badanej cząsteczki do wybranych studzienek. Inkubować.
W warunkach kontrolnych błędna translacja powoduje aktywne wydzielanie lucyferazy.
Jeśli badana cząsteczka hamuje błędną translację, aktywne wydzielanie lucyferazy zmniejsza się.
Przenieś podwielokrotności hodowli na czarną płytkę i zmierz fluorescencję GFP.
Odwirować do granulowania komórek.
Przenieś supernatanty zawierające wydzielaną lucyferazy i dodaj substrat, gdzie aktywna lucyferazy katalizuje jej utlenianie, wytwarzając luminescencję.
Zmierz luminescencję i oblicz stosunek lucyferazy do GFP; Niższy współczynnik wskazuje na mniejsze błędy translacji spowodowane badaną cząsteczką.
Na początek zaszczepij dwa mililitry pożywki 7H9 bakteryjnym szczepem reporterowym.
Wstrz
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych