JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:17 min. • October 30th, 2025
Zacznij od bogatej w składniki odżywcze płytki agarowej uzupełnionej tiosiarczanem.
Smugi cyjanobakterii i inkubuj je na przemian w okresach jasnych i ciemnych, aby utrzymać cykl okołodobowy.
W okresie świetlnym pobieranie składników odżywczych i tiosiarczan wspomaga rozwój bakterii i kondensację DNA.
W ciemnym okresie komórki oszczędzają energię i dzielą się.
Naprzemienny cykl światła i ciemności synchronizuje komórki na tym samym etapie wzrostu i podziału.
Po okresie świetlnym dodaj kilkakrotnie roztwór sacharozy i pipet, aby uwolnić sinice, powodując zmianę koloru. Przenieś komórki do probówki.
Dodaj barwnik fluorescencyjny specyficzny dla DNA i inkubuj w ciemności. Barwnik wiąże się z DNA sinicy.
Odwirować w celu oddzielenia sinic i usunięcia supernatantu.
Zawiesić cyjanobakterie w roztworze sacharozy, przenieść zawiesinę na szkiełko i przykryć.
Pod mikroskopem fluorescencyjnym niebieskie skondensowane DNA w komórkach potwierdza zsynchronizowany, regulowany przez okołodobowy postęp cyklu komórkowego sinicy.
Zacznij od hodowli sinic na dziewięciocentymetrowych, wysterylizowanych płytkach BG-11 zawierających 1,5% agaru i 0,3% tiosiarczanu sodu. Inkubuj płytki w temperaturze 23 stopni Celsjusza w cyklu świetlnym 12-12 z 50 mikro-E światła na metr kwadratowy na sekundę. Aby utrzymać komórki, co tydzień przenoś je na świeże płytki agarowe BG-11.
W ciągu tygodnia kultury pojawiają się jako zielone paski. Przenieś zielone grudki komórek za pomocą wysterylizowanej płomieniowo pętli i rozłóż je na nowej płytce. Aby zaobserwować zagęszczenie DNA, należy zebrać komórki hodowane przez sześć dni pod koniec okresu świetlnego.
Aby uwolnić komórki z płytki, dodaj jeden mililitr 0,2-molowej sacharozy. Następnie zebrać zawiesinę komórkową i powtarzać dodawanie i usuwanie sacharozy, aż roztwór zmieni kolor na zielony. Zmiana koloru wskazuje, że większość komórek została zwolniona.
Teraz przenieś 500 mikrolitrów roztworu zawieszonych komórek do probówki Microfuge i dodaj barwnik Hoechst, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikrograma na mililitr. Następnie pozwól komórkom inkubować w ciemności przez 10 minut. Następnie odwiruj komórki, wyrzuć supernatant i zawieś je ponownie w 10 mikrolitrach 0,2-molowej sacharozy.
Następnie przenieść jeden mikrolitr zawiesiny na szkiełko podstawowe, założyć szkiełko nakrywkowe i obserwować komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w filtr UV. Używając obiektywu 100-krotnego zanurzenia w olejku, poszukaj dowodów na zagęszczenie DNA, które powinny być widoczne w większości komórek.