JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:44 min. • October 30th, 2025
Weź żel SDS-PAGE zawierający prążki białkowe z cząstek białka błonowego i nanolipoproteiny. Kompleksy te przenoszą oligomeryczne białko błonowe Chlamydia lub MP, obiecujący antygen szczepionkowy przeciwko zakażeniu Chlamydią .
Jako kontrolę należy użyć prążków białkowych z oczyszczonego oligomerycznego MP.
Zmontuj żel, membranę western blot i elementy bibuły w suchym systemie bibuły.
Zastosuj prąd elektryczny, aby przenieść rozwiązane białka na błonę.
Usunąć błonę i inkubować ją w buforze zawierającym detergenty i przeciwciała pierwszorzędowe.
Detergenty blokują niespecyficzne miejsca interakcji, podczas gdy pierwszorzędowe przeciwciała są skierowane przeciwko MP.
Umyj błonę, aby usunąć niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe.
Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem skierowanymi na przeciwciała pierwszorzędowe.
Umyj membranę, aby usunąć nadmiar przeciwciał drugorzędowych.
Przechwytywanie obrazów fluorescencyjnych membrany.
Pasma molekularne pasujące do kontrolnego oligomerycznego MP potwierdzają integralność strukturalną MP w kompleksach, wspierając jego potencjał antygenowy.
Rozpuścić próbki za pomocą SDS-PAGE i przenieść stosy żeli za pomocą komercyjnego systemu suchego blottingu do analizy Western blot. Usuń bloty ze stosu i inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w buforze blokującym zawierającym 0,2% TWEEN 20 i 0,5 mikrograma na mililitr MAb40 lub 0,2 mikrograma na mililitr przeciwciała antyHIS-tag MAbHIS skierowanego przeciwko znacznikowi HIS z białka delta-49ApoA1.
Umyj każdą plamę PBST trzy razy przez pięć minut na pranie. Inkubować bloty przez jedną godzinę w buforze blokującym zawierającym przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem w rozcieńczeniu od 1 do 10 000. Powtórz pranie za pomocą PBST i uchwyć obraz za pomocą imagera fluorescencyjnego po ostatnim praniu.