JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:54 min • October 30th, 2025
Zacznij od hodowli cyjanobakterii, które są bakteriami fotosyntetyzującymi.
Bakterie te zawierają bogate w lipidy kropelki plastoglobul i błony tylakoidowe, które są pofałdowanymi błoniastymi strukturami bogatymi w pigmenty fotosyntetyczne.
Odwirować kulturę i wyrzucić supernatant w celu usunięcia zewnątrzkomórkowych polisacharydów wytwarzanych przez bakterie. Umyj granulkę, a następnie ponownie umieść ją w buforze.
Użyj homogenizatora wysokociśnieniowego, aby wytworzyć siłę ścinającą, która rozrywa ściany komórkowe i błony.
Pęknięcie błon tylakoidów uwalnia pigmenty fotosyntetyczne do lizatu. Uwalnianie pigmentu powoduje zmianę koloru, która wskazuje na rozerwanie komórek i uwolnienie plastoglobulki.
Załaduj lizat do probówek wirówkowych, a następnie dodaj roztwór sacharozy, aby utworzyć gradient gęstości.
Odwirować w celu oddzielenia składników komórkowych według gęstości.
Tyrakooidy i inne cięższe składniki osadzają się na dole, podczas gdy plastoglobule o niskiej gęstości unoszą się na górze jako wyraźne pasmo.
Zebrać frakcję plastoglobuli i przechowywać ją przez zamrożenie do dalszej analizy.
Hoduj 50 mililitrów kultury PCC 6802 z gatunku synechocystis w pożywce BG11 przez 7 do 10 dni, aby osiągnąć fazę stacjonarną.
Za pomocą spektrofotometru dostosuj gęstość komórek do gęstości optycznej 2,0 przy 750 nanometrach. Aby usunąć polisacharydy, odwirować 50 mililitrów kultury i usunąć supernatant. Powtórzyć płukanie komórek w 50 mililitrach buforu A dwa razy.
Ponownie zawiesić umyty granulat w 25 mililitrach buforu A i rozbić komórki za pomocą francuskiej komory ciśnieniowej o wadze 1,100 funtów kwadratowych. Powtórz proces trzy razy w niskich temperaturach, aż zlizowany kolor zmieni się z zielonego na czerwono-niebiesko-zielony w białym świetle. Usunąć podwielokrotność homogenatu komórkowego i odłożyć ją na bok w celu przechowywania jako reprezentatywna próbka komórkowa ogółem.
Rozprowadź powstały homogenat w ośmiu trzymililitrowych probówkach ultrawirówek wypełnionych maksymalnie 2,5 mililitra w każdej probówce. Nałożyć ten homogenat na 400 mikrolitrów pożywki R, tworząc gradient krokowy. Ostrożnie zrównoważyć probówki, dodając w razie potrzeby dodatkowe medium R przed odwirowaniem probówek.
Tyrakooidy i inne cięższe organelle, w tym wszelkie ciała polihydroksyalkanianowe, wykazują tworzenie osadów, podczas gdy plastoglobule tworzą żółtą oleistą podkładkę na szczycie gradientu sacharozy lub w jego pobliżu. Zbierz powstałą pływającą podkładkę z surowych plastoglobul za pomocą strzykawki i umieść zbiór w dwumililitrowej probówce.
W razie potrzeby zeskrobać plastoglobulki z boku ścianki probówki ultrawirówki za pomocą końcówki igły. Albo kontynuuj przetwarzanie cyjanobakterii, albo przechowuj surowe plastoglobule w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i oczyść później.