Ocena kolonizacji bakteryjnej jelit u C. elegans wolnych od zarazków

Zacznij od wolnych od zarazków dorosłych robaków C. elegans zawieszonych w pożywce.

Wprowadzić badaną bakterię i inkubować.

Gdy robaki żerują, bakterie dostają się do światła jelita i przylegają do nabłonka.

Odwirować w celu osadzenia robaków i usunięcia niepołkniętych bakterii.

Ponownie zawiesić w buforze, odwirować i usunąć pozostałe niespożyte bakterie.

Dodać pożywkę zawierającą zabite termicznie E. coli i inkubować.

Podczas karmienia zabita termicznie E. coli wypiera i wydala nieprzylegające bakterie testowe ze światła jelita.

Odwirować i usunąć supernatant zawierający wydalone bakterie.

Przemyć buforem, odwirować i usunąć supernatant.

Schłodź robaki na lodzie, aby wywołać paraliż, zapobiegając dalszemu spożyciu.

Dodaj roztwór wybielacza i inkubuj, aby zabić resztki bakterii zewnętrznych.

Usuń wybielacz i dodaj zimny bufor.

Odwirować i usunąć supernatant, aby usunąć resztki wybielacza.

Robaki zachowują teraz tylko żywe bakterie testowe przylegające do nabłonka jelitowego, co umożliwia ilościowe określenie kolonizacji.

Rozpocznij od ponownego zawieszenia próbki robaka w jednym mililitrze M9TX-01 w probówce do mikrowirówki. Zebrać dorosłe robaki przez odwirowanie i wyrzucić supernatant. Stosując te same parametry wirowania, przepłucz robaki dwukrotnie jednym mililitrem M9TX-01 i raz jednym mililitrem bufora robaków M9, aby zminimalizować bakterie zewnętrzne. Następnie ponownie zawieś każdą próbkę w jednym mililitrze pożywki S plus 2X zabity termicznie OP50 w probówce hodowlanej. Inkubuj probówki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 20 do 30 minut, aby usunąć nieprzylegające bakterie z jelit.

Po inkubacji oczyszczone robaki przepłukać dwukrotnie jednym mililitrem zimnego M9TX-01 i wyrzucić supernatant. Połóż rurki na lodzie na 10 minut, aby sparaliżować robaki. Następnie dodaj jeden mililitr lodowatego buforu robaków M9 z bezzapachowym wybielaczem do każdej tubki.

Inkubuj probówki na lodzie przez co najmniej 10 minut, aby zabić bakterie zewnętrzne. Wyrzuć bufor wybielacza i włóż probówki z powrotem do lodu, aby zapobiec pompowaniu robaków. Następnie dodaj jeden mililitr zimnego M9TX-01 do każdej probówki i wiruj przez pięć sekund w mini wirówce. Umieścić probówki z powrotem w lodzie i usunąć supernatant. Powtórz ten krok raz.