JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:03 min • October 30th, 2025
Zacznij od hodowli Legionella pneumophila, bakterii chorobotwórczej.
Te komórki bakteryjne posiadają system wydzielania na błonie, który jest niezbędny do infekcji gospodarza.
Zawieś komórki bakteryjne w sterylnej wodzie, aby osiągnąć gęstość wymaganą do obrazowania kriogenicznej tomografii elektronowej (cryo-ET).
Dodaj nanocząsteczki złota, które służą jako punkty odniesienia do wyrównania obrazu podczas rekonstrukcji trójwymiarowej.
Weź siatkę z perforowaną folią węglową, aby zdeponować próbkę bakteryjną.
Umieść siatkę w komorze wypełnionej gazem i zastosuj wyładowanie elektryczne, aby powierzchnia była bardziej hydrofilowa.
Nałóż zawiesinę na siatkę, pozwalając cieczy równomiernie rozprowadzić się na powierzchni, a komórki osiadają.
Usuń nadmiar wody z siatki i zanurz ją w płynnym podłożu zamrażającym, aby zamrozić próbkę i zachować jej architekturę komórkową.
Próbka jest teraz gotowa do obrazowania krio-ET systemu wydzielania bakteryjnego.
Aby przygotować próbkę kriotomografii elektronowej, hoduj ciężki płat Legionella Pneumophila na płytkach CYE-agar-streptomycyna przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Ponownie zawiesić komórki w wodzie do OD600 wynoszącego około 0,7. Następnie dodaj pięć mikrolitrów koloidalnych cząstek złota do 20 mikrolitrów zawiesiny komórek. Żar rozładować dziurawą siatkę węglową i odpipetować na niej pięć mikrolitrów mieszaniny komórek.
Odstaw na minutę. Osusz siatkę bibułą filtracyjną i zamroź ją w ciekłym etanie za pomocą grawitacyjnego aparatu nurnikowego.