JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:45 min. • November 28th, 2025
Zacznij od rurki zawierającej robaki C. elegans .
Przenieś robaki na wielowarstwową płytkę z bogatym w składniki odżywcze agarozowym medium zawierającym bakterie kontrolne lub testowe.
Podczas inkubacji robaki spożywają bakterie, które kolonizują nabłonek jelit i uwalniają aminokwasy będące źródłem składników odżywczych. Aminokwasy te są metabolizowane do pochodnych aminokwasów i przechowywane w granulatach jelitowych powiązanych z lizosomami.
Następnie dodaj świeży bufor i przenieś robaki na czarną płytkę wielowarstwową.
Dodaj chemiczny czynnik wywołujący stres do każdej studni i uszczelnij płytę.
Włóż płytkę do czytnika płyty fluorescencyjnej i zapisz fluorescencję.
U robaków czynnik stresowy powoduje stres oksydacyjny, który uszkadza komórki nabłonkowe jelit.
Powoduje to pęknięcie granulek jelitowych związanych z lizosomem, uwalniając pochodne aminokwasów, które po ekspozycji na promieniowanie ultrafioletowe fluorescują na niebiesko.
Porównaj fluorescencję robaków wystawionych na bakterie kontrolne i testowe, aby ocenić skuteczność kolonizacji bakterii oraz ich wpływ na reakcję gospodarza na stres oksydacyjny.
Reguluj stężenie robaków do 15 robaków na mikrolitr w stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów. Następnie przelej 8 mikrolitrów roztworu robaka do każdej z dołków ośmiu 96-dołkowych płyt agarozy NGM za pomocą pipety wielokanałowej lub pipety powtarzającej.
Po 36 godzinach należy podać 30 mikrolitrów M9 do każdego dołku na 96-dołowej płytce. Następnie przenieś robaki na płytę 384-dołową zgodnie z układem zestawu, używając końcówek o niskim zatrzymywaniu, aby upewnić się, że czytniki płyt są prawidłowo ustawione. Następnie uzupełnij płytki z 384 dołkami kolejną ilością M9, dążąc do końcowej objętości 60 mikrolitrów na odwór poprzez dodanie 40 mikrolitrów M9 do testu termicznego oraz 34 mikrolitrów M9 w 6 mikrolitrach TBHP dla stresu oksydacyjnego wywołanego TBHP.
Następnie rozpocznij badanie w ciągu dwóch minut od dodania TBHP. Następnie zamknij płytki przezroczystą pokrywką i zabezpiecz krawędzie płytek z 384 dołkami taśmą maskującą, upewniając się, że taśma nie przechodzi na pokrywkę ani pod płytkę. Następnie włóż płytkę do czytnika tablic.