Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania rekombinowanego białka bakteryjnego
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:54 min. • November 28th, 2025
Weź zawiesinę komórek bakteryjnych wyrażających białko docelowe oznaczone polihistydyną.
Sonikat na lodzie, aby zminimalizować rozkład białka. Fale dźwiękowe o wysokiej częstotliwości lizują komórki, uwalniając zawartość wewnątrzkomórkową, w tym docelowe białko.
Wiruj w wirówce, aby oddzielić zanieczyszczenia i przenieść białka zawierające supernatant do strzykawki.
Przefiltruj supernatant, aby usunąć kruszywa i zapobiec zatoraniu kolumny chromatycznej.
Weź kolumnę chromatografii powinowacowej na bazie niklu i wyrównuj ją, aby zapewnić optymalne oczyszczanie białek.
Załaduj filtrat na kolumnę. Znacznik polihistydynowy wiąże się z jonami niklu na żywicy kolumnowej, unieruchamiając białka docelowe.
Przemyj kolumnę buforem, aby usunąć niezwiązane białka, i monitoruj absorpcję UV eluatu, aby potwierdzić ich usunięcie białek niebędących celem.
Dodaj bufor elucyjny zawierający imidazol, który konkuruje z tagiem polisydydynowym o wiązanie niklu, uwalniając białka.
Drugi skok absorpcji UV potwierdza elucię docelowego białka, które jest gotowe do dalszego użycia.
Sonikuj komórki na lodzie, wykonując pięć cykli: 15-sekundowy impuls i 30-sekundową pauzę.
Po odwirowaniu lizatu komórki w temperaturze 21
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych