Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania rekombinowanego białka bakteryjnego

0 wyświetleń2:54 min • November 28th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weź zawiesinę komórek bakteryjnych wyrażających białko docelowe oznaczone polihistydyną.

Sonikat na lodzie, aby zminimalizować rozkład białka. Fale dźwiękowe o wysokiej częstotliwości lizują komórki, uwalniając zawartość wewnątrzkomórkową, w tym docelowe białko.

Wiruj w wirówce, aby oddzielić zanieczyszczenia i przenieść białka zawierające supernatant do strzykawki.

Przefiltruj supernatant, aby usunąć kruszywa i zapobiec zatoraniu kolumny chromatycznej.

Weź kolumnę chromatografii powinowacowej na bazie niklu i wyrównuj ją, aby zapewnić optymalne oczyszczanie białek.

Załaduj filtrat na kolumnę. Znacznik polihistydynowy wiąże się z jonami niklu na żywicy kolumnowej, unieruchamiając białka docelowe.

Przemyj kolumnę buforem, aby usunąć niezwiązane białka, i monitoruj absorpcję UV eluatu, aby potwierdzić ich usunięcie białek niebędących celem.

Dodaj bufor elucyjny zawierający imidazol, który konkuruje z tagiem polisydydynowym o wiązanie niklu, uwalniając białka.

Drugi skok absorpcji UV potwierdza elucię docelowego białka, które jest gotowe do dalszego użycia.

Sonikuj komórki na lodzie, wykonując pięć cykli: 15-sekundowy impuls i 30-sekundową pauzę.

Po odwirowaniu lizatu komórki w temperaturze 21 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut, przefiltruj supernatant za pomocą sterylnego systemu filtrującego strzykawką. Użyj zautomatyzowanego systemu oczyszczania, wyposażonego w pięciomililitrową kolumnę powiązaństwa na bazie niklu, aby oczyścić frakcję RTA oznaczoną HIS z sterylnie filtrowanego supernatantu E.coli . Ogólnie używaj prędkości elucji jednego mililitra na minutę i chłodzi cały system oczyszczania, aby zapobiec nieefektywnemu wiązaniu toksyn i utracie aktywności toksyn.

Krótko wyrównaj kolumnę afinitetów 20 mililitrów buforu wiążącego, aby usunąć bufor magazynowy. Następnie nałóż sterylny, przefiltrowany supernatant na kolumnę powiązaństwa za pomocą strzykawki. Przemyj kolumnę 25 do 35 mililitrów buforu wiążącego, aby usunąć niezwiązane białka z kolumny.

Wykonuj proces mycia aż absorpcja UV w odległości 280 nanometrów zbliży się do początkowej wartości UV. Następnie eluuj związaną frakcję RTA za pomocą 20 do 35 mililitrów buforu elucijnego i utrzymuj próbkę w lodzie. Ważne jest, aby rozpocząć próbkowanie frakcji RTA wkrótce po wzroście wartości UV 280 i zatrzymać próbkowanie ułamków RTA, gdy ponownie osiągnie pierwotną bazę.

09:54

Produkcja i oczyszczanie przeciwciała terapeutycznego na skalę laboratoryjną

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

05:35

Kwantyfikacja wymywania metali w chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

07:19

Oczyszczanie powinowactwa białka oznaczonego 6X-His-His-Tagged przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

10:32

Ortogonalne oczyszczanie białek ułatwione przez mały bispecyficzny znacznik powinowactwa

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

07:44

Wysokoprzepustowe oczyszczanie białek rekombinowanych znakowanych powinowactwem

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

02:59

Oczyszczanie białek oparte na chromatografii anionowej: technika rozdzielania mająca na celu wyizolowanie białka będącego przedmiotem zainteresowania z dializowanego lizatu bakteryjnego na podstawie ładunku netto

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

03:54

Oczyszczanie białek oparte na chromatografii powinowactwa niklu: technika oczyszczania rekombinowanych białek znakowanych polihistydyną z lizatu komórek bakteryjnych

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

03:03

Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

06:03

Oczyszczanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych za pomocą chromatografii powinowactwa

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

11:22

Oczyszczanie GST-His : Dwuetapowy protokół oczyszczania powinowactwa dający oczyszczone białka o pełnej długości

Powiązane filmy

0 Wyświetlenia

Ostatnia aktualizacja: 1 sierpnia 2026