JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:09 min • November 28th, 2025
Weź genetycznie modyfikowaną kulturę E. coli z wyrażeniem operatora tetracykliny chromosomalnej (tetO).
Bakterie te przenoszą także plazmid z promotorem indukowanym przez arabinozą, który napędza ekspresję białka represorowego tetracykliny oznaczonego YFP.
Przełóż hodowlę do wzbogaconego pożywka zawierającego antybiotyki i inkubuj poprzez potrząsanie, aby wybrać komórki zawierające plazmid.
W miarę wzrostu komórek powstają replisomesy, które inicjują replikację chromosomowego DNA.
W fazie wykładniczej zbierz część jako kontrolę nieindukowaną.
Dodaj arabinozą, induktor, do pozostałej kultury i inkubuj obie kultury poprzez potrząsanie nimi.
W hodowli nieindukowanej dimer AraC pozostaje związany z pętlą DNA, hamując ekspresję represorów.
W kulturze indukowanej arabinoza wiąże się z dimerem AraC, indukując ekspresję represorów.
Białka represorowe wiążą się z chromosomalną matrycą tetO, zatrzymując postęp rozwidlenia replikacyjnego.
Użyj mikroskopii fluorescencyjnej, aby obserwować obie hodowle.
Ogniska fluorescencyjne w wywołanej hodowli E. coli potwierdzają blokadę replikacji wywołaną przez białko represorowe.
Do tej procedury stosuje się szczep E. coli z operatorową matrycą tetracyklinową w plazmidzie pKM1. pKM1 koduje TetR-YFP, indukowalne żółte białko fluorescencyjne oznaczone białkiem tetracyklinowym.
Rozcieńcz świeżą nocną hodowlę tego szczepu E. coli do gęstości optycznej 600 nanometrów 0,01 w rozcieńczonym pokładzie złożonym z antybiotykami potrzebnymi do selekcji. Hodować hodowlę w temperaturze 30 stopni Celsjusza z wstrząśnieniem do gęstości optycznej 600 nanometrów od 0,05 do 0,1. Pobierz próbkę 10 mililitrów, aby służyć jako kontrola nieindukowana.
Dodaj 0,01% arabinozy do pozostałej kultury, aby wywołać produkcję TetR-YFP z pKM1. Kontynuuj hodowanie zarówno nieindukowanych, jak i wywołanych hodowli w temperaturze 30 stopni Celsjusza z potrząsaniem. Po godzinie sprawdź obecność pojedynczego punktu ogniskowego w każdej komórce indukowanej hodowli za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Jeśli potwierdzono zablokowanie indukowanych komórek, co wskazuje ponad 70% komórek z jednym ogniskiem, zapisz gęstość optyczną i usuń 7,5 mililitra próbki do analizy za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy żelowej. Usuń równoważną próbkę z nieindukowanej kultury kontrolnej.