JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:48 min • November 28th, 2025
Weź mieszankę główną zawierającą polimerazę DNA wypierającą nici, nukleotydy oraz barwnik wiążący DNA z podwójną nicią do amplifikacji izotermicznej z pętlą lub LAMP.
Dodaj startery zawierające sekwencję odwrotnie komplementarną specyficzną dla docelowego genu bakterii.
Rozprowadz miks master do lamp.
Dodaj do probówek próbki zawierające bakteryjne szablony DNA.
Umieść lampy wewnątrz instrumentu LAMP.
Początkowa denaturacja pozwala primerowi związać się z docelowym DNA.
Gdy polimeraza DNA przesuwająca nici zaczyna syntetyzować nową nić, wypiera istniejącą nici, eliminując potrzebę cyklicznego cyklowania termicznego.
Produkt wzmocniony tworzy strukturę pętlową dzięki odwrotnemu dobieraniu par.
Ta struktura zawiera wiele miejsc startowych dla kolejnego cyklu, co ułatwia wykładniczą amplifikację docelowego DNA.
Barwnik wiąże się z wzmocnionym DNA i emituje fluorescencję.
Monitoruj fluorescencję w czasie rzeczywistym, aby wykryć obecność docelowego genu bakteryjnego w próbkach.
Fizycznie oddziel obszary używane do przygotowania LAMP Master Mix i dodawania szablonów DNA.
Oczyść powierzchnie robocze izopropanolem oraz roztworem degradującym DNA i DNazy. Następnie wyczyść pipety i uchwyty na rurki. Rozmroź izotermiczną mieszankę główną, 10X Primer Mix, wodę o jakości molekularnej, DNA z dodatnim kontrolowaniem oraz matryce DNA w temperaturze pokojowej.
Włącz instrument LAMP i wpisz odpowiednie dane próbki. Przygotuj LAMP Master Mix zgodnie z instrukcjami z rękopisu, krótko go wiruj i wiruj, a następnie rozprowadzaj 23 mikrolitry Master Mix do każdego dołka na pasku rurki. Zrób wszystkie szablony DNA i krótko je odwiruj.
Następnie dodaj dwa mikrolitry szablonu DNA do odpowiedniego dołka i szczelnie go zakryj. Wyjmij pasek z rurki z uchwytu i przetrzaskaj, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki zebrały się na dnie rurki. Załaduj listwę lampową do instrumentu LAMP i rozpocznij bieg LAMP.
Podczas gdy trwa reakcja LAMP, stuknij w zakładki Temperatura, Wzmocnienie i Wyżarzenie, aby zobaczyć dynamiczne zmiany różnych parametrów podczas pracy LAMP.