Przygotowanie próbek Myxococcus xanthus do obrazowania żywymi komórkami

Zacznij od hodowli Myxococcus xanthus, wolno rosnącej bakterii glebowej.

Zaszczep kolonię do podłoża z antybiotykiem.

Komórki zostały zaprojektowane tak, by opierać się antybiotykowi, zapewniając, że przetrwają tylko pożądane bakterie.

Przełóż zawiesinę do większej kolby zawierającej podłoże i inkubuj z potrząsaniem, aby sprzyjać optymalnemu wzrostowi.

Weź zasłonę zamontowaną na metalowej ramie, która zapewnia wsparcie mechaniczne podczas obrazowania.

Rozłóż na niego posiewkę bakteryjną, a następnie dodaj fluorescencyjne mikrosfery, które będą służyć jako punkty odniesienia do wyrównania obrazów podczas wykonywania wielu obrazów.

Połóż podgrzaną podkładkę z agarozą zawierającą podłoże, a następnie nałóż na nią pokrywkę, aby utrzymać nawodnienie.

Inkubuj, aby komórki mogły przykleić się do agarozowej podkładki.

Pad dostarcza komórkom składniki odżywcze, umożliwiając długoterminowe obrazowanie procesów komórkowych w trakcie proliferacji w powoli rosnącej bakterii.

Na początek ponownie zawiesij pojedynczą kolonię M. xanthus w 500 mikrolitrach 1% CTT, uzupełnionej antybiotykami, w sterylnej probówce i przelać całą zawiesinę do kolby Erlenmeyera o pojemności 50 mililitrów zawierającej 5 mililitrów 1% CTT. Przygotuj roztwór mikroskopii agarozowej o stężeniu 1% zawierający 0,2% CTT, mieszając jeden gram agarozy z 80 mililitrami buforu TPM i 20 mililitrami medium 1% CTT. Podgrzej roztwór w mikrofalówce, aż agaroza stanie się stopiona.

Napełnij szalkę Petriego około 60 mililitrami stopionej agarozy i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej. Podgrzej agarozową podkładkę w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez co najmniej 15 minut przed użyciem. Następnie załóż sterylną szklaną pokrywkę na plastikowej lub metalowej ramie z otworem pośrodku. Następnie użyj taśmy, żeby przymocować pokrywkę do ramy.

Dodaj 10 do 20 mikrolitrów wykładniczo rosnących komórek M. xanthus na pokrywkę. Aby dodać fluorescencyjne mikrosfery jako znaczniki fiducjalne komórek, użyj buforu TPM, aby rozcieńczyć mikrosfery do 1:100. Dokładnie potrząśnij zawiesiną kulek i dodaj 5 do 10 mikrolitrów do ogniw.

Z dużej, podgrzanej podkładki 1% agarozy wytnij mały podkład o rozmiarze mniej więcej co pokrywa i połóż go na komórkach. Następnie załóż pokrywę na podkładkę, aby zapobiec parowaniu i utrzymać komórki w wilgotnym środowisku. Inkubuj próbkę mikroskopii w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut, aby komórki mogły przykleić się do spodu agarozowej podkładki przed rejestracją mikroskopii poklatkowej.