Ocena ochrony roli chaperonu aktywowanego kwasem w E. coli pod wpływem stresu kwasowego

Weź rekombinowane hodowle E. coli wrażliwe na stres środowiskowy.

Hodowla testowa zawiera plazmid kodujący kwasem aktywowany chaperon, natomiast hodowla kontrolna zawiera jedynie szkielet plazmidów.

Zaszczepić pojedyncze kolonie w podłożu uzupełnionym antybiotykiem, aby zapewnić zatrzymanie plazmidów, oraz inkubować, aby wspierać wzrost bakterii.

Rozcieńcz posiewy w świeżym podłożu zawierającym antybiotyk i induktor, aby aktywować ekspresję chaperona.

Hodować kultury do fazy średniej logariatu, a następnie rozcieńczać, aby uzyskać określoną gęstość optyczną.

Dodaj kwas obniżając pH, wywołując stres kwasowy.

W hodowli testowej warunki kwaśne aktywują chaperon, który stabilizuje białka komórkowe i zapobiega ich agregacji. W hodowli kontrolnej brak chaperonu powoduje denaturację i agregację białek komórkowych.

Dodaj zasadę, aby zneutralizować pH i zatrzymać stres kwasowy.

Monitoruj wzrost bakterii, mierząc gęstość optyczną w czasie.

Zwiększony wzrost w hodowli testowej wskazuje na ochronną rolę opiekuna podczas stresu kwasowego.

Przygotuj nocną hodowlę w 50 mililitrach LB z ampicyliną i hoduj komórki w temperaturze 200 obr./min i 30 stopni Celsjusza. Rozcieńcz hodowle nocne 40-krotnie do 25 mililitrów LB z ampicyliną.

Hodować bakterię w obecności 0,5% arabinozy przy 30 stopniach Celsjusza i 200 obr./min do gęstości optycznej 600 nanometrów, czyli OD₆₀₀ równej 1,0, aby wywołać ekspresję białek HDEB. W eksperymentach z przesunięciem pH użyj LB z ampicyliną i arabinozą, aby rozcieńczyć komórki do OD₆₀₀ 0,5. Dostosuj odpowiednie wartości pH, dodając odpowiednie objętości pięciomolowego kwasu solnego.

Po wyznaczonych punktach czasowych zneutralizuj hodowle, dodając odpowiednie objętości pięciomolowego wodorotlenku sodu. Monitoruj wzrost zneutralizowanych hodowli i hodowli ciekłej przez 12 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza za pomocą pomiarów przedawkowania.