Ekstrakcja genomowego DNA oparta na lizie termicznej z patogennej bakterii

Zacznij od kolonii patogennej bakterii uprawianej na bogatym w składniki odżywcze medium agarowym.

Wybierz pojedynczą kolonię, która zapewnia genetycznie jednorodną populację komórek bakteryjnych i zmniejsza zmienność podczas genotypowania.

Stosując sterylną pętlę inokulacyjną, przenieś wybraną kolonię do wody ultraczystej, aby zminimalizować ryzyko wprowadzenia zanieczyszczeń do próbki.

Wykonaj zawiesinę w wirze, aby rozbić kolonię i równomiernie rozproszyć komórki bakteryjne.

Następnie podgrzej zawiesinę, aby rozbić otoczkę komórek bakteryjnych, która składa się z błony zewnętrznej, warstwy peptydoglikanu i błony wewnętrznej.

Powoduje to lizę komórek bakteryjnych i uwalnianie wewnątrzkomórkowej zawartości, w tym DNA genomowego, do wody.

Wiruj zawiesinę z dużą prędkością, aby oddzielić zanieczyszczenia komórkowe z DNA genomowego.

Przelej supernatant do świeżej rurki do dalszego procesu genotypowania.

Na początek użyj sterylnych pętli inokulacyjnych do wysiewania czystych kultur Yersinia ruckeri na dowolnym odpowiednim rodzaju agaru na szalkach Petriego. Inkubuj w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni lub w temperaturze 15 stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni. Następnie, używając pętli inokulacyjnej, wybierz jedną reprezentatywną kolonię z każdej szalki Petriego i przenieś ją do rurek wirówek o pojemności 1,5 mililitra, zawierających 50 mikrolitrów ultraoczyszczonej wody do ponownej zawieszki.

Krótko wiruj i inkubuj przez siedem minut na bloku grzewczym w temperaturze 100 stopni Celsjusza. Następnie wiruj w 16 000 g przez trzy minuty i użyj pipety, aby ostrożnie przenieść supernatantowe szablonowe DNA do pustych rurek wirówek o pojemności 1,5 mililitra. Przechodź do kolejnego kroku lub przechowuj DNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.