JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 5:43 min • November 28th, 2025
Weź liść zakażony Candidatus liberibacter, patogenną bakterią.
Pokrój go na kawałki, zamroz na bieżąco w ciekłym azocie i zmiel, aby rozerwać komórki roślinne i uwolnić ich zawartość, w tym bakterie.
Dodaj bufor do lizy jąder i dokładnie wymieszaj.
Inkubować w wysokiej temperaturze, aby lizować błony, uwalniając genomowe DNA z jąder roślin i komórek bakteryjnych.
Dodaj enzym RNazy, odwróć rurkę do wymieszania i inkubuj, aby rozłożyć RNA.
Dodaj roztwór wytrącania białka i wymieszaj, aby wspomóc agregację białek. Wirówka do granulacji białkowej i odpadów komórkowych.
Przełóż supernatant do probówki zawierającej izopropanol i wymieszaj, aby wytrącić DNA w widoczne nici. Wirówka, aby rozpuścić DNA.
Opłucz granulat etanolem, aby usunąć zanieczyszczenia, wysuszyć na powietrzu i ponownie nawilżyć DNA.
Inkubuj w wysokiej temperaturze, aby rozpuścić DNA, a następnie załaduj próbkę do mikrokuwety.
Za pomocą spektrofotometru zmierz stężenie izolowanego DNA.
Najpierw użyj czystych nożyczek, aby odciąć cały świeży liść z drzewa cytrusowego i włóż go do czystej plastikowej torebki na kanapki. Następnie schłodzić moździerz, dodając niewielką ilość ciekłego azotu. Następnie użyj nożyczek, aby wyciąć małe kawałki tkanki liścia, około jednego cala kwadratowego.
Włóż kawałki liści do zaprawy, aby natychmiast je zamrozić. Szybko zacznij mielić tkankę liści moździerzem, aż ciekły azot odparuje i pozostanie drobny zielony proszek. Następnie schłodzić metalową łopatkę w ciekłym azocie przez 10 do 15 sekund. Następnie użyj zimnej łopatki, aby pobrać zmieloną tkankę z moździerza w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.
Użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby dodać 600 mikrolitrów roztworu lizy jąder do próbki. Następnie zabij próbkę na jeden do trzech sekund. Inkubuj rurkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza w kąpieli wodnej przez 15 minut.
Po zakończeniu okresu inkubacji użyj pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby dodać 3 mikrolitry roztworu RNazy do lizatu, aby usunąć RNA. Następnie wymieszaj zawartość rurki, odwracając ją dwa do pięciu razy.
Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut w inkubatorze szafkowym. Po 15 minutach dodaj do próbki 200 mikrolitrów roztworu wytrącania białka. Uruchom rurę z dużą prędkością przez 20 sekund. Następnie odwiruj próbkę w 13000 g przez trzy minuty.
W trakcie wirowania należy dodać 600 mikrolitrów izopropanolu utrzymywanego w temperaturze pokojowej do nowej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Po zakończeniu wirowania ostrożnie usuń supernatant z rurki wirówki do rurki zawierającej izopropanol. Wyrzuć granulkę.
Odwróć rurkę, aby DNA było widoczne, jak nitkowata nitka. Następnie odwiruj próbkę w 13000 g przez minutę w temperaturze pokojowej.
Przelej supernatant po wirówce. Następnie dodaj 600 mikrolitrów 70% etanolu do pelletu. Odwróć rurkę kilka razy, aby umyć granulkę.
Wiruj rurkę w 13000 g przez minutę. Po zakończeniu wirowania ostrożnie zasysaj supernatant. Następnie odwróć tubkę z otwartą pokrywką na chłonnym papierze, żeby wyschła na powietrzu przez 15 minut.
Po wyschnięciu dodaj do pelletu 100 mikrolitrów roztworu rehydratacyjnego DNA. Inkubuj zawiesinę DNA w temperaturze 65 stopni Celsjusza w kąpieli wodnej przez godzinę. Okresowo stukaj w rurkę podczas mieszania.
Dodaj 1 mikrolitr oczyszczonej wody do mikro-cuwette. Odczytaj wodę jako pustą na spektrofotometrze. Następnie dodaj 1 mikrolitr próbki do mikrokuwety. Umieść mikrokuwetę na spektrofotometrze i uzyskaj stężenie DNA.