Ilościowy pomiar translokacji GLUT4 do błony komórkowej przy użyciu cytometrii przepływowej
7 listopada 2010
Niniejszy protokół opisuje szybką technikę ilościowego oznaczania translokacji GLUT4 z cytoplazmy do błony plazmatycznej komórek za pomocą cytometrii przepływowej.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie translokacji GLUT4 do błony plazmatycznej komórek ssaków w odpowiedzi na ekspozycję na insulinę. Mioblasty poddane głodzeniu surowiczym, które posiadają białko GLUT4 wyłącznie wewnątrz pęcherzyków, są najpierw wysiewane do 24-dołkowej płytki hodowlanej. Następnie do komórek dodaje się przeciwciało przeciwko zewnętrznemu epitopowi GLUT4, uprzednio inkubowane z fluorochromem sprzężonym przeciwciałem wtórnym, a w dalszej kolejności insulinę.
Aktywacja receptorów insulinowych na powierzchni komórek prowadzi do translokacji GLUT4 do błony plazmatycznej. GLUT4 jest następnie rozpoznawany przez przeciwciała obecne w medium. W tym momencie komórki można utrwalić, a następnie zmierzyć intensywność barwienia fluorescencyjnego za pomocą cytometrii przepływowej.
Metodę tę można wykorzystać do badania translokacji glikogenu oraz metabolizmu glukozy, ale można ją również zastosować w innych układach, takich jak degranulacja komórek NK poprzez ekspozycję CD 1 0 7 A na błonie. W przypadku tej procedury ważne jest użycie komórek w fazie aktywnego wzrostu lub o stopniu konfluencji od 60 do 80%, które były poddane nocnemu głodzeniu seryjnemu. Po zebraniu komórek za pomocą trypsyny należy je przemyć i resuspender w zwykłej pożywce wzrostowej w stężeniu 200 000 komórek na mililitr; następnie wysiać komórki na płytkę 24-dołkową w ilości 0,1 miliona w 500 µL na dołek. Następnie inkubować komórki przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C, aby umożliwić im regenerację po działaniu trypsyny.
W międzyczasie zmieszaj przeciwciało przeciwko glute four i sprzężone z Alexa Fluor 4 8 8 wtórne przeciwciało anty-chicken IgG w stosunku pięć do jednego; oblicz końcową objętość, przyjmując, że do każdego dołka zostanie zużyte 10 µL mieszaniny przeciwciał. Inkubuj mieszaninę przeciwciał przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Podczas inkubacji mieszaniny przeciwciał przygotuj dwukrotny roztwór roboczy insuliny, rozcieńczając ją do pożądanego stężenia w pożywce wzrostowej.
Po inkubacji komórek przez jedną godzinę należy wyjąć je z inkubatora. Do każdej studni z komórkami ostrożnie dodać 10 µL roztworu przeciwciał. Należy pamiętać, aby pozostawić co najmniej jedną studnię niebarwioną.
Ta próbka negatywna zostanie wykorzystana później do konfiguracji cytometru przepływowego. Następnie do każdej studni dodaj 500 µL dwukrotnego roztworu zapasu insuliny, aby wywołać translokację GLUT4 na powierzchnię komórki, i inkubuj płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności. Po wyjęciu komórek z inkubatora utrwal je, dodając 1 mL PBS z 1% PFA do każdej studni, i inkubuj płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Używając scrapera do komórek, delikatnie odklej utrwalone komórki od dna studni i przenieś je z każdej studni do osobnej probówki FACS.
Odwiruj probówki, aby utworzyć pellet komórkowy, następnie wymieszaj w wirówce typu vortex i resuspenduj komórki w 1 mL PBS w celu ich przemycia, po czym ponownie odwiruj. Powtórz etap przemywania dwukrotnie, odlewając nadsącz po każdym cyklu.
Na koniec resuspenduj przemyte komórki w 400 µL PBS z 1% PFA. Można teraz przystąpić do analizy ekspresji powierzchniowej glute four w cytometrze przepływowym. Po dostarczeniu próbek do cytometru przepływowego rozpocznij akwizycję danych od kontroli niebarwionej.
Zdefiniuj szeroką bramkę dla żywych komórek, wykorzystując parametry rozproszenia światła przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter). Następnie dostosuj ustawienie napięcia dla kanału FL 1, tak aby szczyt negatywny był widoczny w obrębie marginesów histogramu. Po ustaleniu tych parametrów przeprowadź pomiary każdej próbki eksperymentalnej, rejestrując co najmniej 10 000 zdarzeń dla żywych komórek w każdej probówce.
Ten histogram przedstawia zwiększoną ekspresję barwienia powierzchniowego GLUT4 w mioblastach poddanych działaniu 0, 1, 10 lub 100 nM insuliny. W przeciwieństwie do nich, mioblasty pochodzące od osób z insulinoopornością nie wykazują zwiększenia ekspresji GLUT4 w odpowiedzi na 100 nM insuliny. Jeśli średnią intensywność fluorescencji stymulowanych komórek znormalizuje się do wartości komórek niestymulowanych, możliwe jest bezpośrednie porównanie wartości MFI zdrowych i insulinoopornych mioblastów.
Stosując tę procedurę, komórki można barwić na dodatkowe markery powierzchniowe lub wewnątrzkomórkowe, aby zidentyfikować różne podgrupy komórek w populacjach mieszanych.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje szybką technikę ilościowej oceny translokacji GLUT4 z cytoplazmy do błony komórkowej za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta umożliwia wykrycie translokacji GLUT4 w odpowiedzi na ekspozycję komórek ssaków na insulinę.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Metabolizm
- Cytometria przepływowa
Wstęp
- GLUT4 jest transporterem glukozy, który przemieszcza się do błony plazmatycznej w odpowiedzi na insulinę.
- Zrozumienie translokacji GLUT4 jest kluczowe dla badania metabolizmu glukozy.
- Tę metodę można zastosować również do innych procesów komórkowych, takich jak degranulacja komórek NK.
- Głodzenie w surowicy jest niezbędne, aby zapewnić dokładny pomiar translokacji GLUT4.
Cel badania
- W celu ilościowego określenia translokacji GLUT4 do błony plazmatycznej.
- W celu analizy wpływu insuliny na lokalizację GLUT4 w mioblastach.
- W celu przedstawienia protokołu, który może zostać dostosowany do innych badań komórkowych.
Zastosowane metody
- Mioblasty poddane głodzeniu seryjnemu wysiewa się do płytki 24-dołkowej.
- Do znakowania komórek wykorzystuje się przeciwciała przeciwko GLUT4.
- Dodaje się insulinę, aby wywołać translokację GLUT4.
- Do pomiaru intensywności barwienia fluorescencyjnego stosuje się cytometrię przepływową.
Główne wyniki
- Ekspozycja na insulinę prowadzi do znacznej translokacji GLUT4 na powierzchnię komórki.
- mioblasty z insulinoopornością wykazują upośledzoną nadekspresję GLUT4.
- Intensywność fluorescencji może być wykorzystana do porównania komórek zdrowych i insulinoopornych.
- Metoda ta umożliwia dodatkowe barwienie markerów powierzchniowych lub wewnątrzkomórkowych.
Wnioski
- Niniejszy protokół pozwala na skuteczną kwantyfikację translokacji GLUT4 w odpowiedzi na insulinę.
- Można go dostosować do różnych badań komórkowych wykraczających poza obszar metabolizmu glukozy.
- Zrozumienie dynamiki GLUT4 może dostarczyć cennych informacji na temat zaburzeń metabolicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kwantyfikacja translokacji GLUT4 zapewnia bezpośredni odczyt funkcjonalny skuteczności sygnałowania insulinowego w modelach chorób metabolicznych. Ten test oparty na cytometrii przepływowej umożliwia szybką, ilościową ocenę zaangażowania celu i aktywacji szlaku w komórkach wrażliwych na insulinę. Wspiera on wczesną walidację celu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w opracowywaniu terapii cukrzycy i otyłości, łącząc interwencje molekularne z fizjologicznymi mechanizmami poboru glukozy.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pomiar funkcjonalnej translokacji GLUT4 w celu walidacji aktywacji szlaku receptora insuliny w komórkach ssaków.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wysokoprzepustowe przesiewowe badanie związków lub zaburzeń genetycznych wpływających na stymulowaną insuliną ekspozycję GLUT4.
- Wartość prognostyczna: Znormalizowana średnia intensywność fluorescencji pozwala na bezpośrednie porównanie fenotypów zdrowych i insulinoopornych w celu priorytetyzacji celów.
Przesiewanie i opracowanie analizy
- Gotowość analizy: Protokół zostaje zakończony w czasie poniżej 4 godzin i umożliwia analizę od 3 000 do 1 miliona komórek na warunek, co pozwala na skalowanie screeningu.
- Wynik ilościowy: Cytometria przepływowa dostarcza precyzyjne pomiary intensywności fluorescencji korelujące z poziomami GLUT4 na powierzchni.
- Powtarzalność: Obejmuje kontrolę niebarwioną w celu standaryzacji instrumentu i zapewnienia spójności bramkowania pomiędzy eksperymentami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Bezpośrednio modeluje insulinooporność w cukrzycy typu 2 poprzez porównanie translokacji GLUT4 w zdrowych i opornych mioblastach.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Potwierdza, czy badane związki przywracają stymulowaną insuliną translokację w komórkach opornych.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera przejście od identyfikacji celu terapeutycznego do walidacji przedklinicznej poprzez powiązanie działania molekularnego z funkccją transportu glukozy.
Integracja potoków i przepływów pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając ocenę modulatorów szlaku insulinowego – od potwierdzenia celu, aż po walidację funkcjonalną w modelach chorób metabolicznych.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotezy, że związek nasila zależną od insuliny translokację GLUT4 jako mechanizm działania.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe odczyty kompatybilne z cytometrią przepływową, odpowiednie do przesiewania bibliotek związków w systemach komórek adherentnych.
- Analityka: Znormalizowane stosunki MFI zapewniają porównywalność statystyczną między warunkami w celu wyłonienia trafień (hit selection) oraz opracowania profili odpowiedź-dawka.
- Badania translacyjne: Łączy modulację celu z fizjologią wychwytu glukozy, wspierając decyzje o kontynuacji lub przerwaniu (go/no-go) programów badawczych nad chorobami metabolicznymi.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Możliwość adaptacji do innych zdarzeń translokacyjnych (np. degranulacji komórek NK poprzez CD107a), co zwiększa użyteczność platformy w obszarach immunometabolizmu i immuno-onkologii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność mechanistyczną w zakresie modulacji ścieżki insulinowej poprzez kwantyfikację kluczowego efektora downstream sygnalizacji insuliny.
- Wartość operacyjna: Standaryzowany, kompatybilny z utrwalaniem proces roboczy umożliwia przetwarzanie seryjne i powtarzalność między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich, wymagając dowodów na funkcjonalną translokację poza testy wiązania lub fosforylacji.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowany do ryzyka postęp prac poprzez potwierdzenie zaangażowania celu w fizjologicznie istotnym teście transportu glukozy.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w hodowli komórkowej, cytometrii przepływowej oraz technikach immunofluorescencji.
- Metoda jest zależna od cytometru przepływowego z detekcją fluorescencji (np. kanał FITC) i odpowiednimi kontrolami kompensacji.
- Niezbędne jest zastosowanie ustandaryzowanych protokołów głodzenia surowiczego i stymulacji insuliną we wszystkich ośrodkach badawczych.
- Adaptacja do komórek pierwotnych lub alternatywnych modeli może wymagać optymalizacji dostępności przeciwciał oraz warunków fiksacji.
- Metoda ogranicza się do epitopów eksponowanych na powierzchni; nie pozwala na detekcję pul wewnątrzkomórkowych ani całkowitej ekspresji białka bez przeprowadzenia permeabilizacji.
