JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:43 min. • November 28th, 2025
Sprawdź ludzkie komórki ekspresyjne CaeB, antyapoptotyczne białko bakteryjne.
Użyj komórek bez CaeB jako kontroli.
Wprowadź odczynnik transfekcyjny złożony z systemem ekspresji genów indukowanym tetracykliną, zawierającym zarówno plazmidy regulatorowe, jak i odpowiedziowe.
Plazmid regulatorowy koduje aktywator transkrypcji i tłumik, natomiast plazmid odpowiedzi koduje białko pro-apoptotyczne kontrolowane przez TRE.
Inkubuj komórki, aby ułatwić pobieranie plazmidów i ekspresję białek regulacyjnych.
Bez tetracykliny aktywator pozostaje nieaktywny, a tłumik tłumi transkrypcję sterowaną TRE.
Dodaj analog tetracykliny i inkubuj.
Analog umożliwia wiązanie aktywator–TRE, inicjując ekspresję białek pro-apoptotycznej.
W komórkach kontrolnych wywołuje to sygnalizację apoptotyczną, aktywując marker apoptotyczny.
W komórkach ekspresujących CaeB CaeB hamuje sygnalizację apoptotyczną, zmniejszając aktywację markerów.
Zmniejszona aktywacja markerów w komórkach ekspresujących CaeB sugeruje, że CaeB hamuje apoptozę.
Rozpocznij ten zabieg od zasiewania komórek HEK293 stabilnie wyrażających GFP lub GFP-CaeB w płytkach z 12 dołkami o gęstości 100 000 komórek na dołek.
Następnie przygotuj oddzielnie odczynnik transfekcyjny DNA i polietyliminy w 75 mikrolitrach medium Opti-MEM i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Do tworzenia złożonych mieszanin inkubuj obie mieszaniny razem przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj roztwór DNA polietyiminy kropelo do komórek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w stężeniu 5% dwutlenku węgla.
Pięć godzin po transfekcji indukuj ekspresję białek proapoptotycznych, dodając do pożywki jeden mikrogram na mililitr doksycykliny. Następnie inkubuj komórki przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w stężeniu 5% dwutlenku węgla.