Transfekcja indukowalnego systemu ekspresji genów do komórek ekspresujących bakteryjne białko efektorowe

Sprawdź ludzkie komórki ekspresyjne CaeB, antyapoptotyczne białko bakteryjne.

Użyj komórek bez CaeB jako kontroli.

Wprowadź odczynnik transfekcyjny złożony z systemem ekspresji genów indukowanym tetracykliną, zawierającym zarówno plazmidy regulatorowe, jak i odpowiedziowe.

Plazmid regulatorowy koduje aktywator transkrypcji i tłumik, natomiast plazmid odpowiedzi koduje białko pro-apoptotyczne kontrolowane przez TRE.

Inkubuj komórki, aby ułatwić pobieranie plazmidów i ekspresję białek regulacyjnych.

Bez tetracykliny aktywator pozostaje nieaktywny, a tłumik tłumi transkrypcję sterowaną TRE.

Dodaj analog tetracykliny i inkubuj.

Analog umożliwia wiązanie aktywator–TRE, inicjując ekspresję białek pro-apoptotycznej.

W komórkach kontrolnych wywołuje to sygnalizację apoptotyczną, aktywując marker apoptotyczny.

W komórkach ekspresujących CaeB CaeB hamuje sygnalizację apoptotyczną, zmniejszając aktywację markerów.

Zmniejszona aktywacja markerów w komórkach ekspresujących CaeB sugeruje, że CaeB hamuje apoptozę.

Rozpocznij ten zabieg od zasiewania komórek HEK293 stabilnie wyrażających GFP lub GFP-CaeB w płytkach z 12 dołkami o gęstości 100 000 komórek na dołek.

Następnie przygotuj oddzielnie odczynnik tran