JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:35 min. • November 28th, 2025
Rozpocznij od płytki hodowlającej zawierającą bakterie osadzone pod żelową podkładką agarozową, aby unieruchomić bakterie i wspierać wzrost monowarstw.
Bakterie konstytutywalnie wyrażają zielone fluorescencyjne białko, umożliwiając monitorowanie ekspresji genów w czasie rzeczywistym.
Dodatkowy żel agarozowy wokół podkładki przelej próbkę, aby zamknąć próbkę i pozwól jej zastygnąć w temperaturze pokojowej.
Uszczelnij płytę taśmą, przebij ją, aby umożliwić wymianę gazów, i odwróć ją, aby zapobiec kondensacji.
Inkubuj płytkę w niskiej temperaturze, aby ustabilizować żel i zapobiec podziałowi bakterii.
Następnie nałóż olej immersyjny na obiektyw i umieść płytkę na stole mikroskopu konfokalnego.
Rozpocznij obrazowanie poklatkowe.
W miarę stopniowego dojrzewania GFP zaczyna fluorescencje. Podczas podziału komórek te fluorescencyjne białka są rozprowadzane pomiędzy komórkami potomnymi, powodując spadek intensywności fluorescencji.
Tworzy to ząbkowaty wzór fluorescencji, a różnice w tym wzorze między genetycznie identycznymi komórkami w tym samym środowisku wykazują biologiczny szum w ekspresji genów.
Aby zobrazować próbki, wyjmij kolbę z wody i pozwól roztworowi żelowi ostygnąć do temperatury ciała. Wlej trzy milimetry żelu na obwód płytki próbki. Gdy agaroza się zastygnie, zabezpiecz płytę taśmą i użyj igły 25, aby przebić kilka otworów w taśmie.
Następnie ustaw płytkę do góry nogami w temperaturze czterech stopni Celsjusza na co najmniej 30 minut, aby agaroza mogła się całkowicie zastygnąć, jednocześnie zapobiegając mitozie komórek. W ciągu 24 godzin użyj mikroskopu fluorescencyjnego konfokalnego, aby zlokalizować próbkę przy najniższym powiększeniu i uruchomić automatyczny system ostrości mikroskopu. Nałóż olej na odpowiedni obiektyw i użyj kontrolera platformy, aby delikatnie rozprowadzić olej pod kontrolą.
Następnie ponownie włącz automatyczny ostrość i postępuj zgodnie z domyślną sugestią dla przekroju kroku Z, aby zrobić obraz próbki.