JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:23 min. • November 28th, 2025
Zacznij od Staphylococcus aureus zawieszonego w roztworze hartującym zawierającym kulki krzemionki, przechowywane w niskiej temperaturze, aby zachować stan metaboliczny.
Homogenizacja bakterii w warunkach zimnych, aby uwolnić zawartość wewnątrzkomórkową, minimalizując enzymatyczną degradację metabolitów.
Wiruj lizat i pobieraj supernatant bogaty w metabolity.
Do ekstraktu dodaj rozpuszczalnik organiczny oraz wir, aby wytrącić makrocząsteczki z rozpuszczalnych metabolitów.
Wiruj w wirówce, aby wypuścić osad i przenieść supernatant do fiolek.
Załaduj fiolki do systemu chromatografii ciekłej i spektrometrii mas.
Wewnątrz kolumny chromatografii metabolity oddziałują z stałą fazą stacjonarną na podstawie swoich właściwości chemicznych.
Dodaj bufor, aby wylučować metabolity. Następnie skieruj metabolity do źródła jonizacji elektrosprayowej spektrometru masowego, aby je zjonizować.
Jony są następnie rozdzielane na podstawie stosunku masy do ładunku.
Uzyskane dane są porównywane z bazą referencyjną w celu identyfikacji metabolitów.
Aby rozpocząć ekstrakcję metabolitów, najpierw rozmroz próbki na mokrym lodzie. Następnie rozbij ogniwa w homogenizatorze czterema 30-sekundowymi wybuchami z prędkością 6000 obr./min, z dwuminutowymi okresami chłodzenia na suchym lodzie między cyklami.
Oczyszczaj lizaty przez 15 minut w schłodzonej, chłodzonej mikrowirówce z maksymalną prędkością. Po wirowaniu przelej supernatant do czystej rurki mikrowirówki. Za pomocą mikropipety przenieś niewielką część próbki do probówki mikrowirówki w celu ilościowego określenia zawartości peptydów resztkowych, zgodnie z protokołem tekstowym.
Resztę próbki przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Należy odwołać się do protokołu tekstowego analizującego metabolity za pomocą chromatografii cieczowej i spektrometrii mas.