JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:42 min. • January 30th, 2026
Rozpocznij od dodania roztworu zawierającego bakteryjne sondy fluorescencji in situ in situ (FISH) specyficzne dla bakteryjnego 16S rRNA do preparatu zawierającego fragmenty jelita myszy skolonizowane przez bakterie.
Umieść pokrywkę, aby rozprowadzić sondy zawierające ciecz i zapobiec parowaniu.
Inkubuj szkiełko w nawilżonej komorze w podwyższonej temperaturze.
To rozwija strukturę wtórną RNA, ułatwiając hybrydyzację sondy z komplementarnymi sekwencjami w bakteryjnym rRNA 16S.
Usuń slip i inkubuj szkiełko w podgrzanym buforze do prania, aby usunąć niezwiązane sondy.
Płukaj fosforanem buforem, aby utrzymać pH fizjologiczne.
Nałóż barwnik przeciwbarwny zawierający barwnik specyficzny dla śluzu oraz barwnik jądrowy i inkubuj.
Te barwniki selektywnie wiążą się ze śluzem jelitowym oraz z DNA komórek bakteryjnych i gospodarzy. Opłucz zamek buforem i zamontuj pokrywy na zamku za pomocą nośników montażowych.
Pod mikroskopem konfokalnym obserwuj różne bakterie oznaczone przez FISH, komórki jelit oraz warstwę śluzu w przekrojach.
Tworz bardzo ciasne okręgi wokół każdego fragmentu tkanki, używając blokera płynnego lub długopisu PAP, aby ograniczyć obszar rozszerzania potrzebny do pokrycia roztworem hybrydyzacyjnym i unikając kontaktu tuszu z fragmentem.
Przygotuj roztwór hybrydyzacyjny i dodaj 0,5 mikrograma sondy na każde 50 mikrolitrów użytego roztworu. Pipetą nałóż roztwór na przekroje na szkiełku. Nałóż na ten fragment elastyczne plastikowe pokrywki, aby objętość użytej cieczy pokrywała cały odcinek.
Stwórz wilgotną komorę z pudełkiem na pipetę, z chusteczkami lub ręcznikami papierowymi namoczonymi nadmiarem roztworu hybrydyzacyjnego (PBS), aby zapewnić wilgotność. Inkubuj szkiełko w wilgotnej komorze w temperaturze od 45 do 50 stopni Celsjusza przez co najmniej trzy godziny, w zależności od ustawionej sondy, aby ograniczyć parowanie. Usuń plastikowe pokrywki i inkubuj szkiełka w buforze do prania FISH w słoiku Coplin, oba podgrzane do 50 stopni Celsjusza.
Włóż słoik Coplin z powrotem do piekarnika nagrzanego 50 stopni Celsjusza na 10 do 20 minut. Usuń bufor do mycia FISH i zamień go na PBS w słoiku Coplin. Zaraz po uzupełnieniu słoika Coplin PBS, przelej PBS.
Wyjmij szkiełka ze słoika i pipetuj barwnik na całej części, uważając, by nie dotykać chusteczki końcówką pipety. Inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 45 minut. Umyj plamy trzy razy szybko świeżym PBS.
Przetrzyj tył szkiełek chusteczką lub ręcznikiem papierowym i pozwól, by większość PBS odparowała z tych fragmentów, wspomagana przez linię próżniową podłączoną do końcówki pipety. Zamontuj sekcje za pomocą nośnika montażowego. Przyklej pokrywki do slajdu, malując wzdłuż krawędzi przezroczystym lakierem do paznokci, uważając, by nie dotykać krawędzi preparatu. Pozwól mu zastygnąć w temperaturze pokojowej.