JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:04 min • January 30th, 2026
Rozpocznij od hodowli Legionella pneumophila, patogennej bakterii Gram-ujemnej uwalniającej pęcherzyki błony zewnętrznej.
Te OMV zawierają lipopolisacharydy i białka błonowe, które przyczyniają się do zjadliwości bakterii.
Wiruj hodowlę, aby wypuścić nienaruszone bakterie.
Zbierz supernatant zawierający OMV i ponownie wiruj do granulacji bakterii pozostałych.
Przefiltruj supernatant przez membranę, aby usunąć pozostałe bakterie, zachowując jednocześnie OMV.
Wykonaj drugą filtrację za pomocą świeżej membrany, aby usunąć zanieczyszczenia bakteryjne.
Zbierz filtrat wolny od bakterii i poddaj go ultrawirówce, aby rozpylić OMV.
Usuń supernatant, ponownie zawiesij pellet w buforze i ponownie zawiruj w ultrawirówce, aby usunąć luźno powiązane białka i lipopolisacharydy.
Usuń supernatant i ponownie zawiesij oczyszczone OMV w buforze.
Nanieś aliquot OMV na agar krwi i płyty agaru BCYE i inkubować.
Brak formowania się kolonii potwierdza brak skażenia bakteryjnego.
Przechowuj OMV w niskiej temperaturze do badań interakcji gospodarz z patogenem.
Resztę płynnej kultury dodaj do 90 mililitrów świeżego medium YEB i inkubuj ją na obrotowym shakerze, aż osiągnie OD600 wynoszący 3,0 do 3,5. Wiruj hodowlę cieczy o stężeniu 4000 g przez 20 minut, aby rozpylić bakterie. Następnie przelej supernatant do nowych rurek wirówek.
Usuń granulki bakteryjne i ponownie odwiruj próbki, a następnie powtórz proces wirowania. Następnie sterylizuj pozostały supernatant dwukrotnie.
Następnie przenosi się bezbakteriowy supernatant do probówek ultrawirówek i wiruje próbki w temperaturze 100 000 g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 3 godziny. Przelej supernatant i wyrzuć go. Następnie użyj sterylnego PBS, aby ponownie zawiesić pellety OMV i zgromadzić je.
Powtórz krok ultrawirowania, aby usunąć zanieczyszczające białka i wolne LPS. Teraz wyrzuć supernatant i wysusz rurkę ultrawirówki sterylnym patyczkiem kosmetycznym. Ponownie zawiesij pellet OMV z 500 mikrolitrami sterylnego PBS.
Następnie nanieś po 20 mikrolitrów na agar z krwi i płyty agaru BCYE, aby wykluczyć zanieczyszczenie przygotowanego pęcherzyka bakteryjnym. Inkubuj płytkę agarową z krwią przez noc, a płytę agarową BCYE przez 3 dni.