Wykrywanie ekspresji genów docelowych w mózgu myszy zakażonym bakteriami

Weźmy całkowite RNA wyekstrahowane z mózgu myszy zakażonego bakteriami patogennymi. Ekstrakt zawiera transkrypcje genów reagujących na infekcje.

Dodaj enzym degradujący DNA i inkubuj, aby rozłożyć resztki genomowego DNA.

Dodaj mieszankę główną zawierającą enzym transkryptozy odwróconej (RT), nukleotydy i niespecyficzne startery.

Inkubować w celu syntezy DNA komplementarnego (cDNA).

Wprowadź wysoką temperaturę, aby dezaktywować enzym RT.

Weź mieszankę główną zawierającą polimerazę DNA, nukleotydy, dwuniciowy barwnik wiążący DNA oraz startery specyficzne dla docelowego genu.

Dodaj cDNA i zastosuj ciepło, aby zdenaturować DNA.

Primer wiąże się z docelowym cDNA, umożliwiając syntezę nowych nici DNA.

Cykl ten powtarza się, aby wzmocnić gen docelowy.

Barwnik wiąże się z amplifikowanym DNA i emituje fluorescencję, która jest rejestrowana na końcu każdego cyklu.

Wzrost fluorescencji potwierdza ekspresję genu reagującego na infekcje w zakażonym mózgu myszy.

Zainfekuj wszystkie myszy za pomocą komórek planktonowych lub komórek stanu biofilmowego i przeprowadz eutanazję zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie należy wyodrębnić całkowite RNA z tkanki mózgowej za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA.

Dla każdej myszy użyj całej tkanki mózgowej do ekstrakcji RNA. Podziel całą tkankę mózgową na pięć rurek. Weź do 100 miligramów tkanki mózgowej i dodaj 1 mililitr roztworu lizycznego do każdej probówki zawierającej matrycę lizową dostarczoną przez zestaw.

Wyodrębnij RNA zgodnie z krokami opisanymi w protokole tekstowym. Następnie wykonaj syntezę cDNA, w tym eliminację DNA genomowego, za pomocą termocyklera z zestawem odczynników do transkrypcji odwrotnej. Dodaj 1 mikrogram RNA do probówki zawierającej 2 mikrolitry 5x buforu eliminacyjnego genomowego DNA oraz 1 mikrolitr enzymu eliminującego genomowe DNA.

Dodawaj wodę wolną od RNazy, aż objętość osiągnie 10 mikrolitrów. Inkubuj przez 2 minuty w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Dodaj 10 mikrolitrów mieszanki głównej do roztworu reakcji, a następnie delikatnie wymieszaj.

Natychmiast przystąpi do reakcji transkrypcji odwrotnej, umieszczając rurkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 minut. Następnie przenieś reakcję do 85 stopni Celsjusza na 5 sekund. Wykonaj ilościową analizę PCR w czasie rzeczywistym za pomocą maszyny PCR w czasie rzeczywistym z cybernetycznym ilościowym zestawem PCR w czasie rzeczywistym. Zgodnie z instrukcjami z zestawu połącz enzym, sprężarki, 50x ROX referencyjny barwnik 2 oraz szablon cDNA. Następnie dodawaj wodę wolną od RNazy, aż osiągniemy całkowitą objętość 20 mikrolitrów.

Każdą próbkę uruchom w trzech egzemplarzach, używając parametrów termicznych wymienionych w protokole tekstowym i oblicz względną zmianę fałdu na podstawie metody CT 2 minus delta delta.