Ocena in vitro zabijania bakterii przez fagocyty śledziony noworodków myszy

Zacznij od mechanicznej dysocjacji śledziony noworodków myszy, aby wygenerować zawiesinę jednokomórkową.

Przełóż zawiesie do rurki, wirówkę i usuń supernatant.

Ponownie zawiesić pellet w buforze lizy, aby wyeliminować erytrocyty.

Dodaj bufor, ponownie wiruję i usuwam supernatant.

Ponownie zawiesić komórki w buforze i inkubować za pomocą magnetycznych mikrokulek pokrytych przeciwciałami, skierowanych na receptor wyrażany na neutrofilach i zapalnych monocytach.

Wiruj i usuń rozwiązane kulki. Dodaj bufor, następnie przepuścić zawiesinę przez kolumnę ferromagnetyczną i zastosować pole magnetyczne, aby zatrzymać ogniwa związane z kulkami.

Usuń pole magnetyczne, wyluzuj komórki buforem i zasiewaj je w wielodołkowy płatek.

Do wybranych studni należy dodawać rosnące stężenia luminescencyjnych bakterii.

Inkubować, aby neutrofile i monocyty mogły internalizować bakterie przez fagocytozę.

Zamień podłoże na podłoże zawierające antybiotyki, aby wyeliminować bakterie nieinternalizowane.

Rejestruj luminescencję w regularnych odstępach czasu, aby ocenić internalizację bakterii i późniejsze zabijanie wywołane fagocytozą.

Aby wykonać test zabijania bakteryjności in vitro, umieść niezakażoną śledzionę w 40-mikrometrowym sicie nylonowym w sterylnej 60-milimetrowej misce Petriego zawierającej 5 mililitrów PBS z 10% surowicy płodowej bydła, a następnie użyj sterylnej 3-mililitrowej tłoka strzykawkowej do rozbicia tkanki na pojedynczą zawiesinę komórkową. Przełóż komórki do rurki wirówki o pojemności 15 milimetrów i zbieraj je przez wirowanie. Ponownie zawiesij pellet w 1 mililitrze bufora lizy czerwonych krwinek na 3 do 4 śledziony.

Po 5 minutach w temperaturze pokojowej przemyj śledziony w PBS i ponownie zawiesij granulat w 250 mikrolitrach PBS z dodatkiem albuminy surowicy bydłej i 2 milimolarnych EDTA do liczenia. Następnie izoluj komórki Ly6 B2 z odpowiednimi kulkami immunomagnetycznymi zgodnie z protokołem producenta i zasiewaj wzbogacone komórki Ly6 B2 w proporcji 1 razy 10 do 5 komórek na 100 mikrolitrów kompletnego medium na dołek w czarnej lub białej płycie z 96 dołkami. Przygotuj szczepionkę bakteryjną przy pożądanej wielokrotności zakażenia w końcowej objętości 100 mikrolitrów na dołek i dodaj 100 mikrolitrów szczepionki lub podłoża bakteryjnego do każdego dołku, na godzinną inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Po zakończeniu inkubacji należy zastąpić podłoże 200 mikrolitrami świeżego, kompletnego nośnika, uzupełnianego o 100 mikrogramów na mililitr gentamicyny, aby usunąć pozostałe bakterie zewnątrzkomórkowe i zwrócić komórki do inkubatora do hodowli komórkowych na dodatkowe 2 godziny. Po zakończeniu inkubacji i w każdym kolejnym momencie eksperymentalnym używaj czytnika płyt, aby zmierzyć luminescencję w każdej dołku na zakrytej płytce hodowlowej, a następnie wrócić do inkubatora hodowli komórkowej do kolejnego odczytu.