Wykrywanie bakterii in situ w przekrojach tkanki dziąseł myszy

Weź wycień dziąsła myszy zakażony bakteriami patogennymi, wcześniej obdany w celu uzyskania dostępu do DNA bakteryjnego.

Zastosuj bufor z sondą DNA znakowaną digoksygeniną, celującą w DNA bakteryjne.

Załóż pokrywkę i uszczelnienie, aby zapobiec odwodnieniu próbki.

Wprowadź ciepło, aby zdenaturować DNA, a następnie inkubuj w gorących i wilgotnych warunkach, aby umożliwić hybrydyzację sondową.

Schłodzić zamk i zdejmij pokrywkę, a następnie przemyj wielokrotnie z buforem, aby usunąć niezwiązane sondy.

Dodaj roztwór blokujący, aby zapobiec wiązaniu przeciwciał niespecyficznych.

Inkubować przeciwciałami sprzężonymi z enzymami, które wiążą się z digoksygeniną.

Myj, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.

Dodaj inhibitor, aby selektywnie inaktywować endogenny enzym.

Nałóż podłoże reagujące z enzymem, tworząc kolorowy osad.

Przepłucz wodą, aby usunąć nadmiar podłoża.

Dodaj barwnik, aby zabarwić jądra.

Pierz, żeby usunąć nadmiar barwnika.

Susz w etanolu i traktuj ksylenem, aby zwiększyć przezroczystość tkanek.

Zamontuj sekcję.

Pod mikroskopem zwizualizuj bakterie w danym przekroju.

Zacznij in situ, najpierw zanurzając zjeżdżalnie w 2x SSC przez 20 minut. Tymczasem rozcieńcz znakowaną sondę do 1 nanograma na mikrolitr w buforze hybrydyzacyjnym. Dla kontroli ujemnej użyj stężenia 10 razy większego niż sonda nieoznakowana. Następnie denaturuj sondy, podgrzewając je w 90 stopniach Celsjusza przez 10 minut, a następnie szybko schładzając na lodzie.

Następnie należy zastosować taką samą objętość rozcieńczenia sondy na każde szkieletnie jak proteinaza K. Następnie ostrożnie przykryj fragmenty lakierem do paznokci. Następnie podgrzej szkiełka na bloku aparatu PCR w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez 10 minut i przelej je na noc do inkubatora nawilżonego o temperaturze 45 stopni Celsjusza.

Następnego dnia schłodzić zjeżdżalnie do 4 stopni Celsjusza przez pół godziny, a następnie ostrożnie zdejmij pokrywy. Tkanki są delikatne. Na koniec przeprowadź zamki przez serię bufora SSC w temperaturze pokojowej.

Myj hybrydyzowane szkiełka in situ przez 5 minut w MABT. Następnie nałóż 50 do 400 mikrolitrów roztworu blokującego w 1% Tween 20 przez 20 minut. Po inkubacji blokowej należy podać od 50 do 400 mikrolitrów od 1 do 1000 przeciwciał anty-DIG alkalicznych fosfatazy w roztworze blokującym.

Pozwól mu się wiązać przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po nałożeniu podstawowego myj szkiełka w MABT przez 10 minut. Następnie przez 5 minut umieść slajdy w buforze detekcyjnym z 1% Tween 20.

Następnie nałóż 50 do 400 mikrolitrów lewamisolu 1 milimolowego w roztworze buforowym detekcji do każdego preparatu i inkubuj je przez 5 minut, aby inaktywować endogenną fosfatazę alkaliczną. Następnie dodaj od 50 do 400 mikrolitrów NBT/BCIP rozcieńczonych w buforze detekcyjnym w ilości 1 do 100 mikrolitrów do każdego preparatu i pozwól szkiełkom inkubować przez 2 do 3 godzin w nawilżonej komorze, na podstawie doświadczenia.

Przepłucz szkiełka wodą z DI. Następnie nałóż zieleń metylową o stężeniu 0,05% masy objętościowej i pozwól, by barwnik działał na tkance przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ponownie umyj szkiełka wodą DI, a następnie odsusz je 100% etanolem, a następnie zanurz w ksylenie. Na koniec nałóż 80 mikrolitrów materiału montażowego i pokryj szkiełka pokrywą.