Wykrywanie bakterii in situ w przekrojach tkanki dziąseł myszy

Weź wycień dziąsła myszy zakażony bakteriami patogennymi, wcześniej obdany w celu uzyskania dostępu do DNA bakteryjnego.

Zastosuj bufor z sondą DNA znakowaną digoksygeniną, celującą w DNA bakteryjne.

Załóż pokrywkę i uszczelnienie, aby zapobiec odwodnieniu próbki.

Wprowadź ciepło, aby zdenaturować DNA, a następnie inkubuj w gorących i wilgotnych warunkach, aby umożliwić hybrydyzację sondową.

Schłodzić zamk i zdejmij pokrywkę, a następnie przemyj wielokrotnie z buforem, aby usunąć niezwiązane sondy.

Dodaj roztwór blokujący, aby zapobiec wiązaniu przeciwciał niespecyficznych.

Inkubować przeciwciałami sprzężonymi z enzymami, które wiążą się z digoksygeniną.

Myj, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.

Dodaj inhibitor, aby selektywnie inaktywować endogenny enzym.

Nałóż podłoże reagujące z enzymem, tworząc kolorowy osad.

Przepłucz wodą, aby usunąć nadmiar podłoża.

Dodaj barwnik, aby zabarwić jądra.

Pierz, żeby usunąć nadmiar barwnika.

Susz w etanolu i traktuj ksylenem, aby zwiększyć przezroczystość tkanek.

Zamontuj sekcję.

Pod mikroskopem zwizualizuj bakterie w danym przekroju.

Zacznij in situ, najpierw zanurzając zjeżdżalnie w 2x SSC przez 20 minut. Tymczasem rozcieńcz znakowaną sondę do 1 nanograma na m