Name: Monitor motoryki przewodu pokarmowego (GIMM) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Poznaj metodę oceny motoryki okrężnicy w izolowanych fragmentach dystalnego okrężnicy świnki morskiej za pomocą systemu GIMM. Technika umożliwia ilościową analizę motoryki propulsyjnej i badanie wpływu związków farmakologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Przygotowanie tkanki jelita grubego do GIMM
<ol>
<li> Aby przygotować segment końcowej części okrężnicy do monitora motoryki przewodu pokarmowego (Gastrointestinal Motility Monitor, GIMM), należy najpierw umieścić wyizolowaną okrężnicę w lodowatym roztworze Krebsa (121 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl22, 25 mM NaHCO₃3, 1,2 mM NaH2PO4oraz 8 mM glukozy; napowietrzane 95% O22/5% CO2). Usuń pozostałości krezki z zewnętrznej ściany i wykonaj niewielkie nacięcie na końcu jamnym, aby umożliwić jego rozróżnienie po umieszczeniu w kąpieli organowej. Uwaga: tkankę można przechowywać w schłodzonym roztworze Krebsa do 2 godzin przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
<li>Następnie należy umieścić przewody dopływowe i odpływowe w kąpieli organowej w taki sposób, aby znajdowały się one poza polem widzenia kamery, co zapobiegnie zakłóceniom podczas akwizycji obrazu. Kąpiel organową należy stale perfundować podgrzanym wcześniej (37°C) natleniony (95% O2, 5% CO2)2) roztwór Krebsta z szybkością przepływu 10 ml/min.</li>
<li>Zachowując orientację końca oralnego i analnego, przypnij segment okrężnicy dystalnej (co najmniej 5 cm) za oba końce w kąpieli organowej, pozostawiając niewielki luz, aby segment mógł swobodnie przesuwać się do 1 cm w środkowej części. Koniec oralny powinien być skierowany w stronę badacza, aby ułatwić umieszczenie granulatu kałowego. Segmenty okrężnicy powinny być przypinane w ten sam sposób przez tego samego badacza w każdym doświadczeniu w ramach danego zestawu badań, ponieważ długość i napięcie segmentu wpływają na tempo motoryki propulsyjnej, a rozciągnięcie wzdłużne zmniejsza szybkość pasażu (Dickson i wsp., 2007).</li>
<li>Pozostawić preparat do wyrównania potencjałów przez co najmniej 30 min.</li>
</ol>
2. Konfiguracja GIMM i akwizycja danych
<ol>
<li>W systemie GIMM odcinek okrężnicy w komorze perfuzyjnej jest oświetlany od dołu. Nad komorą umieszczono cyfrową kamerę wideo połączoną z komputerem. Należy upewnić się, że zarówno źródło światła, jak i oprogramowanie GIMM są włączone.</li>
<li>Po skonfigurowaniu nowego eksperymentu w aplikacji oprogramowania GIMM, należy rozpocząć pierwszą próbę, wprowadzając powlekaną epoksydą kałową grudkę do ustnego końca odcinka okrężnicy, aby zainicjować perystaltykę. Kliknij przełącznik kamery w komputerze, aby ją uruchomić, a następnie kliknij przycisk nagrywania, aby rozpocząć rejestrację. Ruch grudki w kierunku odbywkowym jest rejestrowany przez kamerę wideo, a cyfrowe nagrania są zapisywane na komputerze PC do późniejszej analizy. Gdy grudka dotrze do końca odcinka okrężnicy, kliknij przycisk nagrywania, aby zatrzymać rejestrację.</li>
<li>Aby uzyskać wartość kontrolną prędkości przesuwania, należy rozpocząć od odcinka okrężnicy pochodzącej od zdrowego zwierzęcia, bez podawania leków. Przeprowadź 3-5 prób na pojedynczym preparacie, z 5 min przerwą na regenerację między kolejnymi uruchomieniami.</li>
<li>Aby określić wpływ określonych warunków lub leków na motorykę okrężnicy, wykonaj 3-5 prób/preparatu dla każdego warunku eksperymentalnego. Ponadto każdy eksperyment należy przeprowadzić na co najmniej pięciu różnych okrężnicach pochodzących od co najmniej pięciu różnych zwierząt.</li>
<li>Podczas analizy cyfrowych nagrań prędkość przesuwania grudki kałowej oblicza się jako czas, w jakim grudka pokona X cm odcinka okrężnicy.</li>
</ol>
3. Konstrukcja map czasoprzestrzennych
<ol>
<li>Cyfrowe nagrania wideo pozyskane z poszczególnych serii pomiarów GIMM mogą zostać przekształcone w mapy czasoprzestrzenne przy użyciu dedykowanego oprogramowania GIMM.</li>
<li>Na osi poziomej zmiany średnicy jelita grubego są naniesione w funkcji czasu poprzez przekształcenie obrazu jelita z każdej klatki wideo w sylwetkę, a następnie obliczenie i konwersję średnicy wzdłuż całej długości na skalę szarości. W rezultacie pellet oraz obszary relaksacji są widoczne jako czarne, natomiast obszary skurczu jako białe.</li>
<li>Odległość, jaką pellet przebył przez segment jelita grubego, jest reprezentowana na osi pionowej.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne mapy spacjoczasowe
<ol>
<li>Przedstawione tutaj reprezentatywne mapy czasoprzestrzenne ukazują motywność treści jelitowych w segmentach okrężnicy w różnych warunkach doświadczalnych. Oś y (pionowa) reprezentuje pozycję treści w czasie, natomiast oś x (pozioma) reprezentuje odległość, jaką treści przebyły przez segment okrężnicy. <img src="/files/ftp_upload/2435/2435fig1.jpg" alt="Schemat procesu elektromigracji, pokazujący warunki prawidłowe, zatrzymanie oraz niedrożność." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> </li>
<li>Na mapie czasoprzestrzennej z kontrolnej okrężnicy (nieleczonej, prawidłowej) treści przemieszczają się liniowo z prędkością ~2 mm/sec. W przeciwieństwie do tego, podanie niektórych leków lub stan zapalny okrężnicy może prowadzić do zaburzeń wzorców motywności, takich jak motywność zatrzymana lub niedrożność motywności.</li>
<li>Wyniki z GIMM mogą być również przedstawione w formie wykresów, w których oś y reprezentuje odległość w milimetrach przebytą przez treści kałowe, a oś x reprezentuje czas w sekundach. Na przykład podanie DAMGO (D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly-ol5), agonisty receptorów opiatowych μ, powoduje spadek motywności napędowej w okrężnicy.</li>
</ol>

<ol><li>Bayliss, W. M., Starling, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+movements+and+innervation+of+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Physiol+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">The movements and innervation of the small intestine.</a> J of Physiol (Lond). 24, 99-143 Forthcoming.</li>
<li>Dickson, E. J., Spencer, N. J., Hennig, G. W., Bayguinov, P. O., Ren, J., Heredia, D. J., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enteric+occult+reflex+underlies+accommodation+and+slow+transit+in+the+distal+large+bowel%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">An enteric occult reflex underlies accommodation and slow transit in the distal large bowel.</a> Gastroenterology. 132, 1912-1924 (2007).</li>
<li>Foxx-Orenstein, A. E., Jin, J. G., Grider, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-HT4+receptor+agonists+and+delta-opioid+receptor+antagonists+act+synergistically+to+stimulate+colonic+propulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">5-HT4 receptor agonists and delta-opioid receptor antagonists act synergistically to stimulate colonic propulsion.</a> Am J Physiol. 275, 979-983 (1998).</li>
<li>Grider, J. R., Foxx-Orenstein, A. E., Jin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxytryptamine4+receptor+agonists+initiate+the+peristaltic+reflex+in+human%2C+rat%2C+and+guinea+pig+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxytryptamine4 receptor agonists initiate the peristaltic reflex in human, rat, and guinea pig intestine.</a> Gastroenterology. 115, 370-380 (1998).</li>
<li>Kadowaki, M., Wade, P. R., Gershon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+5-HT3%2C+5-HT4%2C+and+nicotinic+receptors+in+the+peristaltic+reflex+of+guinea+pig+distal+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Participation of 5-HT3, 5-HT4, and nicotinic receptors in the peristaltic reflex of guinea pig distal colon.</a> Am J Physiol. 271, 849-857 (1996).</li>
<li>Krauter, E. M., Strong, D. S., Brooks, E. M., Linden, D. R., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+colonic+motility+and+the+electrophysiological+properties+of+myenteric+neurons+persist+following+recovery+from+trinitrobenzene+sulfonic+acid+colitis+in+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Changes in colonic motility and the electrophysiological properties of myenteric neurons persist following recovery from trinitrobenzene sulfonic acid colitis in the guinea pig.</a> Neurogastroenterol Motil. 19, 990-1000 (2007).</li>
<li>Langley, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLangley%2C+JN+%22The+Autonomic+Nervous+System%22">The Autonomic Nervous System</a>. , Heffer. Cambridge, UK. (1921).</li>
<li>Linden, D. R., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+excitability+of+myenteric+AH+neurones+in+the+inflamed+guinea-pig+distal+colon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced excitability of myenteric AH neurones in the inflamed guinea-pig distal colon.</a> J Physiol. 547, 589-601 (2003).</li>
<li>Linden, D. R., Sharkey, K. A., Ho, W., Mawe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclooxygenase-2+contributes+to+dysmotility+and+enhanced+excitability+of+myenteric+AH+neurones+in+the+inflamed+guinea+pig+distal+colon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cyclooxygenase-2 contributes to dysmotility and enhanced excitability of myenteric AH neurones in the inflamed guinea pig distal colon.</a> J Physiol. 557, 191-205 (2004).</li>
<li>Linden, D. R., Chen, J. X., Gershon, M. D., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+availability+is+increased+in+mucosa+of+guinea+pigs+with+TNBS-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Serotonin availability is increased in mucosa of guinea pigs with TNBS-induced colitis.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 285, 207-216 (2003).</li>
<li>Linden, D. R., Couvrette, J. M., Ciolino, A., McQuoid, C., Blaszyk, H., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indiscriminate+loss+of+myenteric+neurones+in+the+TNBS-inflamed+guinea-pig+distal+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Indiscriminate loss of myenteric neurones in the TNBS-inflamed guinea-pig distal colon.</a> Neurogastroenterol Motil. 17, 751-760 (2005).</li>
<li>Lomax, A. E., Mawe, G. M., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+facilitation+and+enhanced+neuronal+excitability+in+the+submucosal+plexus+during+experimental+colitis+in+guinea-pig%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic facilitation and enhanced neuronal excitability in the submucosal plexus during experimental colitis in guinea-pig.</a> J Physiol. 564, 863-875 (2005).</li>
<li>Lomax, A. E., O'Hara, J. R., Hyland, N. P., Mawe, G. M., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+alterations+to+enteric+neural+signaling+in+the+guinea+pig+colon+following+the+resolution+of+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Persistent alterations to enteric neural signaling in the guinea pig colon following the resolution of colitis.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, 482-491 (2007).</li>
<li>Strong, D. S., Cornbrooks, C. F., Roberts, J. A., Hoffman, J. M., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+neuromuscular+transmission+is+selectively+attenuated+in+ulcerated+regions+of+inflamed+guinea+pig+distal+colon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Purinergic neuromuscular transmission is selectively attenuated in ulcerated regions of inflamed guinea pig distal colon.</a> J Physiol. 588, 847-859 (2010).</li>
<li>Wade, P. R., Chen, J., Jaffe, B., Kassem, I. S., Blakely, R. D., Gershon, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+function+of+a+5-HT+transporter+in+crypt+epithelia+of+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract.</a> J Neurosci. 16, 2352-2364 (1996).</li>
<li>Wood, M. J., Hyman, N. H., Mawe, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Daikenchuto+%28DKT%29+on+Propulsive+Motility+in+the+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">The Effects of Daikenchuto (DKT) on Propulsive Motility in the Colon.</a> J Surg Res. , (2009).</li>
</ol>

Produkcja tego filmu była sponsorowana przez Catamount Research and Development, Inc, firmę produkującą instrument wykorzystany w niniejszym artykule.

Nerwowo zależna motoryka propulsyjna w przewodzie pokarmowym została po raz pierwszy opisana ponad wiek temu przez Baylissa i Starlinga (Bayliss and Starling, 1899). Obserwacja ta doprowadziła do zdefiniowania nerwów jelit jako enterycznego układu nerwowego (ENS), który stanowi odrębną część autonomicznego układu nerwowego (Langley, 1921). Neurogenna perystaltyka jelitowa obejmuje rozciąganie i/lub stymulację śluzówki w danym punkcie, co wywołuje odruchowe skurcze powyżej (w kierunku ustnym) poziomu bodźca oraz rozkurcz w kierunku odbytowym. Wynikiem tego procesu jest wytworzenie gradientu ciśnienia, który przesuwa zawartość światła jelita w kierunku od ust do odbytu. W jelicie cienkim wielu gatunków oraz w jelicie grubym szczura fale skurczów perystaltycznych mogą być aktywowane poprzez infuzję płynu do światła segmentów jelita. W dystalnej części okrężnicy świnki morskiej do końca ustnego okrężnicy można wprowadzić naturalne lub sztuczne pellety kałowe, a następnie łatwo monitorować ich przemieszczanie się wzdłuż segmentu jelita. W związku z tym dystalna część okrężnicy świnki morskiej stanowi prosty i użyteczny model do badania motoryki propulsyjnej w jelitach.
Perystaltyka jest złożonym odruchem nerwowym, w który zaangażowanych jest szereg związków neuroaktywnych i receptorów. W związku z tym związki wpływające na neurotransmisję w ENS wpływają na szybkość motoryki napędowej. Serotonina, uwalniana głównie z komórek enterochromafilnych w błonie śluzowej jelita, uczestniczy w inicjowaniu odruchu perystaltycznego. Wykorzystując końcowy odcinek okrężnicy świnki morskiej, Grider i współpracownicy wykazali, że motoryka napędowa jest wzmacniana przez podanie do światła jelita agonistów receptora 5-HT4 (Foxx-Orenstein et al., 1998; Grider et al., 1998), podczas gdy aplikacja do kąpieli antagonistów receptorów 5-HT3 i 5-HT4 zmniejsza szybkość przesuwania treści (Kadowaki et al., 1996; Linden et al., 2003b). Ponadto hamowanie transportera serotoniny za pomocą selektywnych inhibitorów zwrotnego wychwytu serotoniny (SSRI) zwiększa perystaltykę przy niskich stężeniach, natomiast zmniejsza ją przy wyższych stężeniach, co prawdopodobnie wynika z desensytyzacji receptorów 5-HT (Kadowaki et al., 1996; Wade et al., 1996). Innymi cząsteczkami sygnałowymi przyczyniającymi się do motoryki napędowej u świnki morskiej jest acetylocholina działająca na receptory nikotynowe, która jest głównym mediatorem przekazywania sygnałów międzyneuronalnych w jelitach. Blokowanie transmisji synaptycznej za pomocą heksametonium, antagonisty receptorów nikotynowych, zmniejsza przesuwanie treścika przy wysokich stężeniach, podczas gdy niższe stężenia nie wpływają na szybkość przesuwania (Kadowaki et al., 1996). Opiaty oraz agoniści receptorów opioidowych, o których od dawna wiadomo, że działają hamująco na motorykę przewodu pokarmowego, zmniejszają przesuwanie treścika w modelu motoryki napędowej świnki morskiej (Foxx-Orenstein et al., 1998; Wood et al., 2009). Co ciekawe, daikenchuto, tradycyjny japoński lek ziołowy stosowany klinicznie w leczeniu wymiotów, bólów brzucha i zaburzeń motoryki, zmniejsza szybkość przesuwania treścika po podaniu wraz z naloksonem (antagonistą opioidów), a podany samodzielnie powoduje perystaltykę wsteczną (Wood et al., 2009). Wyniki te ilustrują użyteczność modelu motoryki napędowej świnki morskiej w ocenie wpływu różnych związków i ich receptorów na wzorce motoryki okrężnicy.
Liczne badania wykazały, że stan zapalny prowadzi do zmian w właściwościach elektrycznych i synaptycznych neuronów okrężnicy (Linden et al., 2003a; Lomax et al., 2005), a zmiany te mogą utrzymywać się przez wiele tygodni po ustąpieniu stanu zapalnego (Krauter et al., 2007; Lomax et al., 2007). Wpływ zmian neuroplastycznych indukowanych przez colitis na motorykę propulsyjną można badać w dystalnej części okrężnicy świnki morskiej przy użyciu systemu GIMM. System ten posiada kilka zalet w porównaniu z tradycyjną metodą monitorowania motoryki okrężnicy, która ocenia motorykę propulsyjną poprzez proste pomiar czasu, w jakim pellet kałowy pokonuje daną odległość. Wcześniejsze badania nad indukowaną stanem zapalnym plastycznością neuronalną w okrężnicy wskazały na spadek prędkości transportu pelletów (Linden et al., 2003a; Linden et al., 2005), jednak nowsze badania z wykorzystaniem systemu GIMM ujawniły bardziej złożone zmiany (Strong et al., 2010). Na przykład tempo transportu pelletów jest zmniejszone w obszarach owrzodzenia w zapalnej dystalnej części okrężnicy, podczas gdy motoryka jest przyspieszona w obszarach sąsiednich – zjawisko to nie zostało rozpoznane przy użyciu wcześniejszej metody „stoperowej”. Inne badania wykazały, że dysmotoryka w aktywnej fazie stanu zapalnego może zostać cofnięta poprzez hamowanie COX-2 (Linden et al., 2004), jednak zmieniona motoryka, która utrzymuje się po ustąpieniu stanu zapalnego, jest niewrażliwa na COX-2 (Krauter et al., 2007). Co więcej, w tych późniejszych badaniach mapy czasowo-przestrzenne generowane przez system GIMM ujawniły schodkowy wzorzec motoryki okrężnicy obserwowany u zwierząt po zapaleniu, co przyczynia się do obniżenia tempa transportu.
Podsumowując, test napędowej motoryki dystalnego odcinka okrężnicy świnki morskiej stanowi wysokoprzepustową metodę pomiaru wpływu badanych związków i stanów patologicznych na motorykę okrężnicy. Ponadto system GIMM zapewnia prostą i przejrzystą metodę oceny napędowej motoryki okrężnicy in vitro. Umożliwia on ciągłe pomiary przesuwania się treści jelitowej (pelletów), a także generowanie map czasoprzestrzennych w celu badania wzorców aktywności spontanicznej. W porównaniu z tradycyjnymi metodami pozwala on również na uchwycenie bardziej złożonych zjawisk, które mogą być ilościowo określone i analizowane na wiele sposobów, ponieważ pliki cyfrowe są zapisywane w systemie i pozostają łatwo dostępne.

<table><tbody><tr><td>Roztwór Krebsa&amp;rsquo;</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Znieczulenie</td><td>Webster Veterinary</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuleczka kałowa powlekana epoksydem</td><td></td><td></td><td></td><td>naturalna kuleczka kałowa świnki morskiej, wysuszona i powlekana epoksydem (czarny lakier do paznokci)</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikronóżki</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szpile ze stali nierdzewnej</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zlewki</td><td></td><td></td><td></td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Butla z gazem</td><td></td><td></td><td></td><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Stoper</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monitor motoryki przewodu pokarmowego</td><td></td><td>Catamount Research and Development</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.catamountresearch.com/products/gimm.htm">http://www.catamountresearch.com/products/gimm.htm&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

monitor motoryki przewodu pokarmowego (gimm)

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

Monitor Motoryki Przewodu Pokarmowego (Gastrointestinal Motility Monitor, GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) to system in vitro służący do monitorowania motoryki napędowej w izolowanych odcinkach końcowej części okrężnicy świnki morskiej. Kompletny system składa się z komputera, kamery wideo, oświetlonej kąpieli organowej, pomp cyrkulacyjnych do kąpieli wodnej (perystaltycznej i podgrzewanej) oraz dedykowanego oprogramowania GIMM do rejestracji i analizy danych. W porównaniu z tradycyjnymi metodami monitorowania perystaltyki okrężnicy, system GIMM umożliwia ciągłą, ilościową ocenę motoryki. Końcowy odcinek okrężnicy świnki morskiej jest zanurzony w ogrzanym i natlenionym roztworze Krebsa, a wprowadzone do końca proksymalnego grudki kału są przesuwane wzdłuż odcinka okrężnicy z prędkością około 2 mm/sec. Nagrywane są filmy przedstawiające przemieszczanie się grudki kału wzdłuż odcinka, a oprogramowanie GIMM pozwala na śledzenie postępu tej grudki. Prędkości motoryki napędowej można uzyskać dla całego odcinka lub dla dowolnego wybranego obszaru. Oprócz analizy wzorców motoryki indukowanej przejściem treści (bolusa), z przechwyconych segmentów wideo można stworzyć mapy czasoprzestrzenne w celu oceny wzorców spontanicznej aktywności motorycznej. Zastosowania tego systemu obejmują farmakologiczną ocenę wpływu agonistów i antagonistów receptorowych na motorykę napędową, a także ocenę zmian wynikających ze stanów patofizjologicznych, takich jak stan zapalny czy stres. Test motoryki napędowej końcowej części okrężnicy świnki morskiej z wykorzystaniem systemu GIMM jest przejrzysty i łatwy do opanowania, zapewniając niezawodną i powtarzalną metodę oceny motoryki napędowej.

Ocena motoryki okrężnicy w dystalnej części jelita grubego świnki morskiej przy użyciu monitora motoryki przewodu pokarmowego (Gastrointestinal Motility Monitor – GIMM) jest prostym i łatwym do opanowania podejściem do ilościowej oceny motoryki propulsywnej w przewodzie pokarmowym.

Monitor Motoryki Przewodu Pokarmowego (GIMM)

Monitor motoryki przewodu pokarmowego (Gastrointestinal Motility Monitor, GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) to system in vitro służący do monitorowania motoryki napędowej...

Monitor motoryki przewodu pokarmowego zapewnia prostą i powtarzalną metodę monitorowania motoryki napędowej w izolowanych odcinkach dystalnej części okrężnicy świnki morskiej. Procedura rozpoczyna się od usunięcia okrężnicy z organizmu zwierzęcia i kąpieli w podgrzanym, natlenionym roztworze Krebsa. Następnie do końca jamnego wprowadza się granulki kału, które są przesuwane wzdłuż odcinka okrężnicy widocznego na nagraniu.Rejestrowane są nagrania przemieszczającej się wzdłuż segmentu kuleczki kałowej, a oprogramowanie śledzi jej postępy. Oprócz analizy szybkości motoryki propulsyjnej, z zarejestrowanych fragmentów wideo można tworzyć mapy czasoprzestrzenne w celu oceny wzorców spontanicznej aktywności motorycznej. Ostatecznie system ten może być wykorzystany do określenia wpływu związków farmakologicznych na wzorce motoryki propulsyjnej, a także do oceny zmian wynikających ze stanów patofizjologicznych.Główną zaletą monitora motoryki przewodu pokarmowego w porównaniu z tradycyjnymi metodami monitorowania motoryki okrężnicy jest to, że system ten umożliwia ciągłą ilościową ocenę przesuwania się treści jelitowej. Ponadto cyfrowe nagrania wideo z każdej próby w danym eksperymencie są zapisywane w systemie i mogą być reanalizowane w razie potrzeby. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu fizjologii układu pokarmowego, takie jak rola różnych układów neurotransmiterów w motoryce okrężnicy poprzez ocenę wpływu agonistów lub antagonistów receptorów na przesuwanie się treści, a także w badaniu wpływu takich czynników jak stres lub stan zapalny na wzorce motoryki propulsyjnej.Aby przygotować segment dystalnego okrężnicy do monitora motoryki przewodu pokarmowego, należy umieścić wyizolowaną okrężnicę świnki morskiej w lodzie. W schłodzonym roztworze Crebsa wykonuje się niewielkie nacięcie na końcu oralnym, aby można było go rozpoznać podczas późniejszego umieszczenia okrężnicy w kąpieli organowej. Tkanka może pozostać w schłodzonym roztworze Crebsa do dwóch godzin przed rozpoczęciem eksperymentu.Próby zastosowania tego podejścia w jelitach szczura i myszy zakończyły się ograniczonym sukcesem, podczas gdy spójne wyniki można uzyskać w przypadku okrężnicy świnki morskiej. Po przygotowaniu do rozpoczęcia eksperymentu, przenieś okrężnicę do kąpieli organowej. Kolejny krok zazwyczaj stanowi największe wyzwanie dla badaczy.W przypadku osób rozpoczynających pracę z tą techniką, podczas mocowania fragmentu okrężnicy w kąpieli organowej należy zastosować odpowiednią siłę naciągu. Stopień naciągu preparatu może bowiem wpływać na motorykę poprzez aktywację odruchów rozciągania. Z tego powodu fragment okrężnicy powinien być mocowany w ten sam sposób przez tego samego badacza w każdym doświadczeniu w ramach danego zestawu eksperymentów.Kontrolując orientację końców ustnej i odbytniczej, przypnij odcinek dystalnego jelita grubego o długości co najmniej pięciu centymetrów na obu końcach w kąpieli organowej, pozostawiając niewielki luz, aby odcinek mógł swobodnie przesuwać się do jednego centymetra w środkowej części. Po przypięciu jelita grubego usuń pozostałości tkanki z zewnętrznej ściany, aby nie zakłócały one działania oprogramowania do automatycznego śledzenia. System monitorowania motoryki przewodu pokarmowego składa się z komory perfuzyjnej oświetlonej od dołu, cyfrowej kamery wideo umieszczonej nad komorą oraz komputera; pompy perystaltyczne i grzewcze pompy kąpieli wodnej łączą przewody dopływowe i odpływowe z kąpielą organową, zapewniając ciągłą perfuzję kąpieli organowej uprzednio ogrzanym do 37 °C i natlenionym roztworem Krebsa z przepływem 10 ml/min.Koniec bliższy otworu ustnego okrężnicy, zaznaczony wcześniej wykonanym nacięciem, powinien być skierowany w stronę badacza, aby ułatwić umieszczenie granulki kałowej. Należy pozostawić preparat do wyrównania stanu równowagi przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem pozyskiwania danych.Zazwyczaj w tym czasie następuje wydalanie naturalnych kulek kałowych. Aby przygotować monitor motoryki przewodu pokarmowego do akwizycji danych, należy najpierw włączyć źródło światła, a następnie uruchomić dedykowane oprogramowanie i skonfigurować nowy eksperyment w aplikacji. Rozpocznij od segmentu okrężnicy pobranego od zdrowego zwierzęcia, bez podawania jakichkolwiek leków, aby uzyskać wartość kontrolną dla szybkości przesuwania się kulek kałowych.Ponieważ napięcie odcinka jelita grubego może ulec zmianie podczas ogrzewania tkanki w kąpieli organowej, należy ponownie naciągnąć odcinek tak, aby zachować pożądaną ilość luzu. Jelito powinno swobodnie przemieszczać się do jednego centymetra w części środkowej; w razie potrzeby należy odciąć nadmiar tkanki z preparatu. Kliknij dwukrotnie próbę w obrębie nowego eksperymentu i włącz kamerę, klikając przełącznik.Zacznij od wprowadzenia powleczonej epoksydem kałowej kulki do końca jamnego odcinka okrężnicy. Aby zainicjować perystaltykę, kliknij przycisk nagrywania w komputerze, by rozpocząć rejestrację. Ruch kulki w kierunku odbytniczym jest rejestrowany przez kamerę wideo, a nagrania cyfrowe są zapisywane w komputerze do późniejszej analizy.Gdy pellet dotrze do końca odcinka okrężnicy, kliknij przełącznik rejestracji, aby zatrzymać nagrywanie. Przeprowadź od trzech do pięciu prób w ramach jednej preparacji, zachowując pięciominutowy okres odpoczynku między kolejnymi przebiegami. Aby określić wpływ określonych warunków lub leków na motorykę okrężnicy, wykonaj od trzech do pięciu prób w każdej preparacji dla każdego warunku eksperymentalnego.Dodatkowo należy przeprowadzić każdy eksperyment na co najmniej pięciu różnych okolonikach pochodzących od co najmniej pięciu różnych zwierząt. Szybkość przesuwania się pelletów kałowych oblicza się jako czas, w jakim pellet pokonuje X centymetrów segmentu okolonika. Wyniki przedstawiono na wykresach czasu i odległości, w których oś Y reprezentuje odległość w milimetrach przebytą przez pellet kałowy, a oś X reprezentuje czas w sekundach; jak pokazano w tym przykładzie z okolonika kontrolnego, pellet przemieszczał się liniowo z prędkością około dwóch milimetrów na sekundę.Otrzymane dane można wyeksportować w postaci plików tekstowych do programu Excel w celu przeprowadzenia dalszej analizy. W przeciwieństwie do grupy kontrolnej, podanie określonych leków lub wystąpienie stanu zapalnego w okrężnicy może prowadzić do zaburzeń wzorców motoryki, takich jak zatrzymanie motoryki oraz motoryka z przeszkodami. Cyfrowe nagrania wideo uzyskane z poszczególnych serii pomiarowych mogą zostać przekształcone w mapy czasoprzestrzenne za pomocą specjalistycznego oprogramowania, aby ocenić wzorce spontanicznej aktywności motorycznej lub wizualnie ocenić postęp przemieszczania się pelletu kałowego wzdłuż osi poziomej.Zmiany średnicy okrężnicy są nanoszone na wykres w funkcji czasu poprzez konwersję obrazu okrężnicy z każdej klatki wideo na sylwetkę oraz obliczenie i konwersję średnicy wzdłuż całej długości na skalę szarości. Efektem końcowym jest obraz, na którym treści jelitowe w obszarach rozluźnienia wydają się czarne, natomiast obszary skurczu wydają się białe, co zilustrowano na mapie czasowo-przestrzennej okrężnicy kontrolnej. Oś Y reprezentuje pozycję treści jelitowych w czasie.Podczas gdy oś x reprezentuje odległość, o jaką granulat przesunął się przez odcinek okrężnicy w porównaniu z grupą kontrolną, mapy czasoprzestrzenne te ukazują zahamowaną i zablokowaną motywność wywołaną podaniem określonych leków lub stanem zapalnym w okrężnicy. Dzięki temu rozwiązaniu możemy teraz oceniać motywność wzdłuż odcinka okrężnicy, a nie tylko wyznaczać prędkość w całym odcinku, a także oceniać aktywność spontaniczną w tej samej preparacji. Po przeszkoleniu w prostym protokole, zastosowanie tej techniki zajmuje około dwóch godzin, a badania na więcej niż jednym zwierzęciu można przeprowadzić w ciągu jednego dnia, stosując tę procedurę.Na tej samej tkance można przeprowadzić inne metody in vitro, takie jak rejestracje elektrofizjologiczne.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Monitor mobilności przewodu pokarmowego (GIMM)

Pooperacyjny niedrożność jelit (POI) jest powikłaniem operacji w obrębie jamy brzusznej, prowadzącym do zwiększonej zachorowalności i przedłużonego pobytu w szpitalu. Ze względu na brak strategii profilaktycznych lub terapeutycznych konieczne są intensywne badania. W związku z tym opracowaliśmy zstandaryzowany i wykonalny model mysi, aby zbadać patofizjologię POI oraz przestudiować potencjalne opcje terapeutyczne.

Funkcjonalna ocena motywności jelit i stanu zapalnego ściany jelita u gryzoni: analizy w zestandaryzowanym modelu manipulacji jelitowej

Pomiar in vivo skurczów mięśni gładkich wzdłuż przewodu pokarmowego zwierząt laboratoryjnych pozostaje potężną, choć niedostatecznie wykorzystywaną techniką. Elastyczne, dwuelementowe tensometry nie są dostępne na rynku i wymagają produkcji. Protokół ten opisuje budowę niezawodnych, niedrogich tensometrów do ostrej lub przewlekłej implantacji u gryzoni.

Wytwarzanie i wszczepianie miniaturowych dwuelementowych tensometrów do pomiaru in vivo skurczów przewodu pokarmowego u gryzoni.

Ostatnio dostępne techniki nagrywania wideo i mapowania czasoprzestrzennego (STmap) umożliwiają wizualizację i ilościowe określenie zarówno propagacji, jak i mieszania wzorców motoryki jelit. Celem tego protokołu jest wyjaśnienie generowania i analizy map STmap przy użyciu systemu monitorowania ruchliwości przewodu pokarmowego (GIMM).

Mapowanie czasoprzestrzenne ruchliwości jelit w preparatach ex vivo jelit

Ten artykuł opisuje technikę obrazowania wideo i mapowanie czasoprzestrzenne o wysokiej rozdzielczości w celu identyfikacji zmian w neuronalnej regulacji ruchliwości okrężnicy u dorosłych myszy. Subtelny wpływ na czynność przewodu pokarmowego (GI) można wykryć przy użyciu tego podejścia w izolowanych preparatach tkankowych, aby pogłębić naszą wiedzę na temat chorób przewodu pokarmowego.

Obrazowanie wideo i mapy czasoprzestrzenne do analizy motoryki przewodu pokarmowego u myszy

To innowacyjne urządzenie wykorzystuje czujniki magneto-inercyjne, aby umożliwić analizę chodu i aktywności w niekontrolowanych środowiskach. Obecnie w procesie kwalifikacji jako miernik wyniku w Europejskiej Agencji Medycznej, jednym z wniosków będzie pełnienie funkcji klinicznego punktu końcowego w badaniach klinicznych w chorobach nerwowo-mięśniowych.

Domowy monitor do analizy chodu i aktywności

Aby zbadać, jak jelito cienkie radzi sobie z cząstkami o różnych rozmiarach, zmodyfikowaliśmy ustaloną metodę in vivo, aby określić pasaż jelita cienkiego.

Badanie mechanowykrywania cząstek świetlnych w jesionym jelicie cienkim

Prezentujemy metodę izolowania rurki jelitowej szczurów i oceny wpływu leków na ich napięcie, częstotliwość i amplitudę in vitro. Metoda ta stanowi cenne podejście dla naukowców badających rurki jelitowe.

Wykorzystanie systemu perfuzji tkanek in vitro do wykrywania czynności funkcjonalnych izolowanych rurek jelitowych w czasie rzeczywistym

Protokół ten opisuje ilościowy test defekacji u młodych mutantów RAC1/CED-10 Caenorhabditis elegans, oferując prosty model do badania stadij choroby Parkinsona prodromalnej. Przezwycięża ograniczenia innych modeli zwierzęcych i ułatwia testowanie strategii terapeutycznych skierowanych do wczesnej patologii Parkinsona.

Ocena ruchliwości przewodu pokarmowego u mutantów Caenorhabditis elegans RAC1/CED-10 jako narzędzie do badania wczesnej choroby Parkinsona

Demonstrujemy, że nadekspresja receptorówy czynnika wzrostu naskórka (EGFR) zwiększa ruchliwość neuralnych komórek macierzystych (NSCs) z wykorzystaniem nowatorskiego urządzenia mikroprzepływowego opartego na żelu agarozy. Technologia ta może być łatwo zaadaptowana do innych systemów komórek ssaków, w których źródła komórek są ograniczone, takie jak ludzkie neuralne komórki macierzyste, a czas realizacji badania jest krytyczny.

Ocena mobilności neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem mikroprzepływowego urządzenia opartego na żelu agarozy

Opisana jest łatwa i niezawodna technika wizualizacji i ilościowego określania ruchliwości rzęsek w drogach oddechowych oraz przepływu generowanego przez rzęski za pomocą tchawicy myszy.  Technikę tę można zmodyfikować w celu określenia, w jaki sposób szeroki zakres czynników wpływa na ruchliwość rzęsek, w tym czynniki farmakologiczne, czynniki genetyczne, narażenie środowiskowe i/lub czynniki mechaniczne, takie jak obciążenie śluzem.

Ex vivo Metoda obrazowania w wysokiej rozdzielczości ruchliwości rzęsek w nabłonku dróg oddechowych gryzoni

Poznaj metodę oceny motoryki okrężnicy w izolowanych fragmentach dystalnego okrężnicy świnki morskiej za pomocą systemu GIMM. Technika umożliwia ilościową analizę motoryki propulsyjnej i badanie wpływu związków farmakologicznych.

Monitor Motoryki Przewodu Pokarmowego (GIMM)

Przeglądaj więcej filmów