Izolacja i hodowla bakterii z zarodków danio dano w celu oceny obciążenia infekcją

Weźmy zarodek danio pręgowanego zakażony bakterią Mycobacterium abscessus, patogenną bakterią atakującą ośrodkowy układ nerwowy i tworzącą ropnie zawierające bakterie oraz komórki odpornościowe gospodarza.

Inkubuj zarodek na lodzie, aby go unieruchomić, a następnie poddaj go przedawkowaniu znieczulenia, aby zatrzymać aktywność serca i nerwów, co skutkuje śmiercią.

Przemyj zarodek, aby usunąć resztki znieczulenia.

Dodaj roztwór detergentu, aby rozbić błony komórkowe i zlikwidować zarodek.

Przeciń lizat przez igłę, aby ujednolicić tkankę i uwolnić bakterie.

Wirówkuj, wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić pellet w roztworze powierzchniowo czynnego, aby zapobiec zgrudkowianiu się bakterii.

Rozcieńczaj seryjnie zawiesinę bakteryjną i rozprowadzaj ją na płytkach agarowych.

Podłoże jest uzupełniane antybiotykami hamującymi wzrost innych mikroorganizmów, podczas gdy komórki Mycobacterium zaprojektowane pod kątem oporności na antybiotyki się mnożą.

Inkubować w celu wspierania tworzenia kolonii, umożliwiając ilościowe określenie obciążenia bakteryjnego zarodka.

Aby wyliczyć jednostki tworzące kolonie lub CFU w pożądanym momencie, należy zebrać pięć zarodków na każdy stan infekcji i przenieść każdy zarodek do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Znieczulony krioanestezyjnie przez inkubację w lodzie przez 10 minut. Po uśpieniu zarodków podaniem 300 do 500 miligramów tricainy na litr, użyj sterylnej wody do dwukrotnego przemycia zarodków w nowej rurce.

Następnie po usunięciu wody o stężeniu 2% Triton X-100 w 1 x PBS do każdego zarodka używam igły 26 gauge, aby ujednolicić tkankę w celu pełnej lizy.

Po odwirowaniu zawiesziny użyj 1 x PBST, aby ponownie zawiesić pellet. Następnie szeregowe rozcieńczanie płyt homogenatów na Middlebrook 7H10O^ADC uzupełnione BBL MGIT PANTA.

Inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 4 dni przed liczeniem kolonii.