Przygotowanie skrawków, organotypowe hodowanie tkanek i rejestracja aktywności genów zegarowych za pomocą lucyferazy w jądrze nadskrzyżowaniowym

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie sposobu krojenia i wyizolowania jądra nadskrzyżowaniowego z myszy transgenicznych oraz hodowli tkanki jądra nadskrzyżowaniowego w celu rejestracji ekspresji genu lub białka zegarowego jako luminescencji indukowanej przez lucyferazę. Cel ten osiąga się poprzez wyizolowanie mózgu z myszy transgenicznej zawierającej reporter lucyferazowy dla genu lub białka zegarowego, a następnie wykonanie przekroju mózgu zawierającego jądro nadskrzyżowaniowe. Drugim krokiem procedury jest wyizolowanie małych, obustronnych jąder nadskrzyżowaniowych z wykonanego przekroju.

Trzecim krokiem procedury jest hodowla schematycznego eksplantu jądra na membranie w płytce Petriego zawierającej pożywkę hodowlaną i lucyferynę. Ostatnim krokiem procedury jest rejestracja aktywności lucyferazy poprzez pomiar bioluminescencji za pomocą fotopowielaczy w szczelnej od światła, podgrzewanej komorze. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące oscylacje okodobowe genu lub białka zegarowego.

Nazywam się Sergey IV i pracuję w klubie Gabrielle Re. Nazywam się SoFi Johansson i pracuję w zespole Gabrielli. Nazywam się Gabriel Quist.

Jestem głównym badaczem w Departamencie Neuronauk, a moje nazwisko to Ka LaShon; jestem doktorantką w Szwedzkim Centrum Neuronauk Medycznych i współpracuję z Gabrielą. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak Western Blot, RT-PCR i hybrydyzacja in situ, jest możliwość ciągłego śledzenia ekspresji genu lub białka zegarowego przez wiele dni w tej samej tkance z bardzo wysoką rozdzielczością wynoszącą około jednej minuty, co pozwala na szczegółową analizę okresu, amplitudy i fazy rytmu okołodobowego. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy cięcia i sekcji tkanek są trudne do opanowania.

SEN jest bardzo mały i może być trudny do zidentyfikowania. Procedurę zademonstruje dr Sge Velia, stażysta postdoktorski w moim zespole badawczym. Po przygotowaniu niezbędnych roztworów, należy przygotować płytki Petriego, które zostaną użyte w eksperymencie, używając strzykawki o pojemności five milliliter wypełnionej wcześniej smarem próżniowym do autoklawów.

Nanieś smar na górną powierzchnię pierścienia 35 milimetrowej szalki Petriego. Przygotuj oddzielną szalkę Petriego dla każdego plasterka kultury. Napełnij probówkę Falcon 10 mililitrami buforowanej pożywki hodowlanej.

Pozwoli to na przygotowanie wystarczającej ilości pożywki dla ośmiu kultur. Dodaj 10 µL świeżo rozmrożonego lucyferianu. Lucyferian jest wrażliwy na światło, dlatego należy chronić pożywkę z lucyferianem przed światłem, przechowując probówkę Falcon w ciemnej komorze inkubacyjnej o temperaturze 37 °C.

Następnie wysterylizuj wszystkie instrumenty, szkiełka nakrywki oraz inne materiały wykorzystywane w procedurze. Spryskaj cały niesterylny sprzęt 70% ethanol. Naświetlaj instrumenty oraz nasmarowane szalki Petriego promieniami UV w sterylnej komorze przez co najmniej 30 minut.

Kolejnym krokiem przygotowawczym jest ustawienie wibratomu i przymocowanie sterylnego ostrza żyletki. Sprzęt jest teraz przygotowany do procedury chirurgicznej. Po znieczuleniu i dekapitacji myszy, należy usunąć gałki oczne z głowy za pomocą nożyczek.

Zapobiega to trenowaniu lub pobudzaniu nerwów wzrokowych, co pomaga uniknąć uszkodzenia jądra nadskrzyżowaniowego (SCN). Za pomocą precyzyjnych nożyczek usuń ostatni kręg szyjny oraz skórę. Wykonaj dwa nacięcia w kości czaszki wzdłuż obu jej stron, tworząc w ten sposób usuwalną klapkę.

Otwórz czaszkę za pomocą narzędzia micro Rongeur. Używaj narzędzia, wykonując ruchy w górę, nigdy nie naciskając nim na mózg. Aby zapobiec uszkodzeniu jądra nadskrzyżowaniowego (SCN), usuwaj kość aż do momentu, gdy widoczne staną się opuszki węchowe.

Za pomocą precyzyjnych nożyczek mikrodysekcyjnych ostrożnie przetnij nerw wzrokowy pomiędzy półkulami a opuszkami węchowymi. Umieść płytkę Petriego wypełnioną 50 do 100 mililitrów zimnego HBSS pod głową myszy. Odwróć głowę do góry dnem, aby nienaruszony mózg mógł swobodnie wypaść.

Przeciąć pozostałe nerwy czaszkowe w razie potrzeby po stronie przeciwnej do nerwu wzrokowego. Po oddzieleniu mózg wpada do szalki Petriego, co powoduje jego szybkie schłodzenie. Za pomocą łyżki przenieść lodowaty mózg na sterylną powierzchnię do cięcia, taką jak odwrócona do góry dnem pokrywka szalki Petriego.

Usunąć móżdżek, wykonując prostopadłe cięcie sterylnymi żyletkami pomiędzy półkulami a móżdżkiem. Nanieść superglue na suchą platformę urządzenia. Wprowadzić ostre zakrzywione pęsety w części rostralnej mózgu i uchwycić mózg, trzymając go za pomocą pęset.

Ostrożnie osusz HBSS za pomocą sterylnego papieru filtracyjnego. Przymocuj półkule do kleju na platformie, kierując wierzchołek rostralny do góry, a powierzchnię brzuszną najbliżej ostrza tnącego. Umieść platformę w uchwycie wibrotomu i natychmiast wypełnij go zimnym HBSS.

Jeśli cięcie prostopadłe zostało wykonane prawidłowo, półkule powinny stać pionowo. Celem jest wykonanie przekrojów wieńcowych obejmujących środkowy region obustronnych SCN, przy użyciu maksymalnej prędkości wibratomu. Należy odcinać sekcje półkul o grubości od 500 do 800 mikrometrów, aż do osiągnięcia commissary. Obserwuj.

W miarę jak skrzyżowanie wzrokowe staje się szersze, przy jednoczesnym zmniejszeniu grubości przekrojów do 100 µm, kontynuuj krojenie w kierunku brzuszno-grzbietowym, spowalniając poziomy ruch ręczny noża, aż zaczną pojawiać się dwa jądra SCN. W razie potrzeby użyj lupy, aby zwizualizować jądra po osiągnięciu poziomu SCN. Wykonaj przekrój SCN o grubości 250 µm.

Napełnij pokrywkę od średniej wielkości szalki Petriego zimnym roztworem HBSS, używając miękkiego pędzla. Podnieś i przenieś przekrój mózgu SCN do szalki Petriego. Umieść szalkę Petriego pod stereomikroskopem.

Kolejnym krokiem jest wycięcie SCN z preparatu. Za pomocą mikroskopu należy zweryfikować, czy obustronne SCN są wyraźnie widoczne przynajmniej po jednej stronie przekroju. Używając pary sterylnych skalpeli, należy wyciąć kwadrat tkanki o boku około 1,5 mm, zawierający oba SCN.

Przetnij tkankę jak najbliżej SCN. Bez usuwania tkanki SCN należy do preparatu dołączyć niewielki fragment nerwu wzrokowego, jednak nie powinny zostać uwzględnione żadne inne jądra. Przetnij tkankę zawierającą obustronne SCN na pół, aby uzyskać dwa jednostronne SCN.

Jeden jednostronny SCN może służyć jako kontrola w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przy wyłączonym świetle należy dodać 1200 µL medium Lucifer do szalki Petriego o średnicy 35 mm, a następnie umieścić membranę hodowlaną na powierzchni cieczy. Należy upewnić się, że pod membraną nie ma pęcherzyków powietrza.

Implantaty są bardzo małe i trudne do podniesienia. Dlatego należy użyć pipety 1000 µL z końcówką, aby zassać eksplant SEN do końcówki, a następnie wycisnąć go na membranę hodowlaną. Usunąć nadmiar HBSS przed pomiarem lucyferazy; w każdej szalce Petriego należy umieścić tylko jeden SEN.

Uszczelnij szalkę Petriego z tłuszczem szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 40 mm. Dodaj więcej tłuszczu, jeśli uszczelnienie nie jest szczelne. Przenieś szalki Petriego do aparatury aluma cycle umieszczonej w zaciemnionej komorze grzewczej o temperaturze od 36 do 37 °C.

Aby rozpocząć hodowlę, należy zwrócić uwagę na naczynia hodowlane oraz zestawy detektorów z lampą fotopowielaczową zamontowane wewnątrz komory cyklu lum. Naczynia hodowlane należy umieścić około jednego do dwóch centymetrów poniżej lamp fotopowielaczowych. Lampy fotopowielaczowe wykrywają i wzmacniają sygnał lucyferazy indukowany luminescencją.

Oprogramowanie Luma Cycle służy do akwizycji danych. Liczbę fotonów integruje się w odstępach od jednej do 10 minut, aby uzyskać wysoką rozdzielczość ekspresji białka genu. Analizuje się okołodobową ekspresję białka genu, aby określić fazę, okres i amplitudę rytmu.

Rysunek ten przedstawia zapisy bioluminescencji z hodowli tkanek SCN zdrowych i niezdrowych. Myszy te były utrzymywane w cyklu 12 godzin światła i 12 godzin ciemności przed pobraniem tkanki SCN. Czarna linia obrazuje rytm dobowy zapisów bioluminescencji ekspresji lucyferazy period dwa.

W zdrowym plastrze SEN białko oscyluje zgodnie z rytmem dobowym, w którym maksymalna ekspresja białka występuje w czasie ze gaber, między 12 a 13 godziną lub na początku ciemności. Zatem faza rytmu genu zależy od harmonogramu cyklu światło-ciemność, w którym zwierzę przebywało przed uśmierceniem. Niebieska linia przedstawia pomiary bioluminescencji z kultury SE, która wyschła po otwarciu naczynia hodowlanego w czwartym dniu, co zaznaczono strzałką, z powodu nieprawidłowego zamknięcia.

Czerwona linia przedstawia zapisy bioluminescencji z niezdrowej hodowli SCN. Rysunek ten obrazuje zastosowanie hodowli SCN w eksperymencie farmakologicznym. Na rysunku widoczny jest zapis z hodowli, która została poddana działaniu blokera kanałów jonowych HCN w czasie wskazanym przez pierwszą strzałkę.

W ciągu dwóch do trzech dni bloker kanałów jonowych zmniejszył, a następnie zatrzymał oscylację okołodobową w miejscu wskazanym przez drugą strzałkę. Podczas wykonywania tej procedury lek wypłukano i zastąpiono kondycjonowaną pożywką kontrolną. Należy pamiętać o szybkim, lecz ostrożnym działaniu, aby zachować żywotność tkanki SEN.

Ważne jest również ustandaryzowanie sekcjonowania w wibrotomie, aby za każdym razem uzyskać ten sam poziom SEN. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak kroić i preparować kulturę SEN oraz organ SCN, zazwyczaj na membranie, a także jak monitorować ekspresję genów lub białek zegarowych jako luminescencję indukowaną lucyferazą w kulturach.