Name: Przygotowanie plastrów, organotypowa hodowla tkanek i rejestracja aktywności genu zegara w jądrze nadskrzyżowaniowym za pomocą lucyferazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-15T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Poznaj metodę preparowania plastrów jądra nadskrzyżowaniowego myszy transgenicznej i hodowlę organotypową z rejestracją aktywności genu zegara przy użyciu lucyferazy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była finansowana przez Szwedzką Radę Badań Medycznych (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61X-20700-01-3); FONCICYT 000000000091984; fundacje Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, Märtha Lundqvist oraz Sigurd och Elsa Goljes Minne; a także Szwedzkie Towarzystwo Medyczne SLS-95151. Wyrażamy wdzięczność profesorowi Gene D. Blockowi z UCLA za cenne uwagi do manuskryptu. Dziękujemy dr. Michaelowi Andängowi i dr Helenie Johard za dostarczenie blokera kanałów HCN oraz prof. Abdelowi El-Manira za udostępnienie mikroskopu wideo.
Kwestie etyczne:
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami ustalonymi przez Karolinska Institutet oraz „Stockholm's Norra Djurförsöksetiska Nämnd”. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach są przeprowadzane z zamiarem zminimalizowania wszelkiego możliwego stresu lub dyskomfortu zwierzęcia.

<ol><li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suprachiasmatic+nucleus%3A+cell+autonomy+and+network+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).</li>
<li>Green, D. J., Gillette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythm+of+firing+rate+recorded+from+single+cells+in+the+rat+suprachiasmatic+brain+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice.</a> Brain Res. 245, 198-200 (1982).</li>
<li>Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythmic+changes+of+neuronal+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+the+rat+hypothalamic+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice.</a> Brain Res. 247, 154-158 (1982).</li>
<li>Groos, G., Hendriks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+in+electrical+discharge+of+rat+suprachiasmatic+neurones+recorded+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro.</a> Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).</li>
<li>Klein, D., Moore, R., Reppert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+suprachiasmatic+nucleus+and+the+circadian+timing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Suprachiasmatic+nucleus--The+mind%27s+clock%22%5BJournal%5D)">The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system.</a> Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , Oxford University Press. New York. 13-15 (1991).</li>
<li>Pol, A. N. V. anden <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypothalamic+suprachiasmatic+nucleus+of+rat%3A+intrinsic+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy.</a> J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats.</a> Science. 288, 682-685 (2000).</li>
<li>Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. ay <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+monitoring+of+circadian+rhythms+in+c-fos+gene+expression+from+suprachiasmatic+nucleus+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures.</a> Curr Biol. 7, 758-766 (1997).</li>
<li>Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li>
<li>Yamazaki, S., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+luminescence+reporting+of+circadian+gene+expression+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals.</a> Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).</li>
<li>Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+preparation+time+on+phase+of+cultured+tissues+reveal+complexity+of+circadian+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization.</a> J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Academic Press. (1997).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , 4 Edition, Academic Press. San Diego. (1998).</li>
<li>O'Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP-dependent+signaling+as+a+core+component+of+the+mammalian+circadian+pacemaker%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker.</a> Science. 320, 949-953 (2008).</li>
<li>Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+altered+period1+expression+in+the+suprachiasmatic+nuclei+of+Vipr2-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice.</a> J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).</li>
<li>Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythm+of+Period1+clock+gene+expression+in+NOS+amacrine+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina.</a> Brain Res. 1050, 101-109 (2005).</li>
<li>Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+clock+nucleus%3A+a+multiphasic+oscillator+network+regulated+by+light%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light.</a> J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).</li>
<li>LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+half-life+GFP+mouse+model+for+analysis+of+suprachiasmatic+nucleus+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization.</a> Brain Res. 964, 279-287 (2003).</li>
<li>Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+response+of+Period+1+expression+within+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus.</a> J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).</li>
<li>Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+of+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats.</a> Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).</li>
<li>Croning, M. D., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+brain+slice+chamber+designs+for+investigations+of+oxygen+deprivation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro.</a> J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).</li>
<li>Burgoon, P. W., Boulant, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+properties+of+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).</li>
<li>Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+pacemaker+in+the+cultured+suprachiasmatic+nucleus+from+pup+mice+is+highly+sensitive+to+external+perturbation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation.</a> Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).</li>
<li>Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+the+ovarian+circadian+clock+is+regulated+by+gonadotropins%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins.</a> Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).</li>
<li>Kohn, R. A., Dunlap, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+the+buffering+capacity+of+bicarbonate+in+the+rumen+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro.</a> J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).</li>
<li>Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photic+and+circadian+expression+of+luciferase+in+mPeriod1-luc+transgenic+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).</li>
<li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence%2Fluminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Zalety i wady technologii raportowej opartej na lucyferazie
W przeciwieństwie do metod ex vivo, takich jak RT-PCR, hybrydyzacja in situ i Western blot, które wymagają pobierania próbek tkankowych w wielu różnych punktach czasowych (co daje niską rozdzielczość czasową, zazwyczaj 2-4 h w zależności od częstotliwości pobierania), w celu badania dobowych zmian w ekspresji genów i białek, technologia reporterowa lucyferazy umożliwia badania oscylacji okołodobowych o wysokiej rozdzielczości (1-10 min) przez wiele dni w tej samej preparacji. Dzięki temu zminimalizowano liczbę wykorzystywanych zwierząt i możliwe są szczegółowe badania wpływu na fazę i okres rytmu, co zazwyczaj nie jest osiągalne przy użyciu konwencjonalnych technik pobierania próbek o niskiej rozdzielczości czasowej. Należy jednak podkreślić, że mimo możliwości pomiaru względnej amplitudy rytmu, technologia reporterowa nie jest ilościowa, a zatem nie może być stosowana do pomiaru ilości transkrybowanych genów lub translowanych białek.
Rejestrację sygnałów z tkanki można rozpocząć i analizować natychmiast po hodowli, co stanowi ogromną zaletę przy bezpośrednim badaniu molekularnych efektów stresu in vivo, przesunięć fazy indukowanych światłem in vivo itp. Organotypowa hodowla SCN umożliwia długoterminową (trwającą tygodnie) manipulację farmakologiczną tkanką dorosłego mózgu zawierającą nienaruszoną, dojrzałą sieć synaptyczną, a technologia reporterowa oparta na lucyferazie pozwala na stabilne pomiary przez wiele tygodni. Dzięki temu tkanka nie musi pochodzić z okresu neonatalnego lub wczesnopostnatalnego, aby uzyskać zdrowe hodowle, a w przeciwieństwie do ostrych przekrojów, możliwe jest prowadzenie przewlekłych terapii farmakologicznych. W przeciwieństwie do transfekcji plazmidowych reporterów w hodowlach komórkowych, które nie prowadzą do wbudowania DNA w genom, transgeniczne modele zwierzęce z lucyferazą (podobnie jak transfekcje lentiwirusowe) są korzystne w przypadku badania zmian epigenetycznych. W tym kontekście należy również wspomnieć, że obrazowanie luminescencyjne jest obecnie możliwe dzięki wysokoczułym kamerom CCD 11, co pozwala na rejestrację sygnałów nawet z pojedynczych neuronów SCN (~ 6-10 μm) i innych typów komórek, co jest wykorzystywane przez główne laboratoria badające rytmy okołodobowe. Wreszcie, wielu badaczy rytmów okołodobowych powszechnie stosuje monitorowanie ekspresji molekularnej przy użyciu innych reporterów, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP), w celu badania oscylacji genów/białek zegarowych 16-19.
Kwestie dotyczące grubości przekroju
Rekomendowana tutaj grubość przekroju SCN (200-300 μm) może zostać zmniejszona lub zwiększona w zależności od potrzeb. Jednak mimo że tkanka spłaszcza się na membranie po kilku dniach hodowli, nie zaleca się przekraczania grubości 500 μm początkowo wyciętego przekroju, aby zachować żywotność tkanki 7. Przekrój o grubości mniejszej niż 100 μm jest ze względów mechanicznych i praktycznych trudny w obsłudze. Ponieważ tkanka SCN jest heterogeniczna, grubość przekroju może wpływać na fazę sygnału wyjściowego lucyferazy, ponieważ różne obszary w obrębie SCN (na przykład „rdzeń” w przeciwieństwie do „otoczki” oraz obszary grzbietowe w przeciwieństwie do brzusznych) oscylują z różnymi fazami 20 i różnie resynchronizują się po przesunięciach fazowych 21. Grubość przekroju wpływa również na poziom bazowy liczby fotonów, ponieważ większa ilość tkanki emituje większą liczbę fotonów. W ten sposób amplituda oscylacji molekularnych może być pośrednio zależna od wielkości eksplantu. Z tych powodów hodowle kontrolne i traktowane powinny zawsze mieć ten sam rozmiar, grubość i zawierać ten sam obszar SCN, aby oscylowały w tej samej fazie i z tą samą amplitudą. Z kolei dwa jednostronne jądra oscylują w fazie względem siebie i z podobnymi amplitudami, pod warunkiem że cięcie wibratomem jest poziome, a nie pod kątem (co z kolei zależy od tego, czy cięcie separacyjne między móżdżkiem a obiema półkulami jest prostopadłe do powierzchni stołu). Badacz przeprowadzający hodowle SCN może zauważyć, że hodowle SCN nie oscylują w fazie względem siebie. Praktyka i standaryzacja techniki cięcia, t.o. zawsze wycinanie przekrojów na tym samym poziomie rostro-kaudalnym SCN, poprawią końcowy wynik.
Kluczowe etapy
<ol>
<li>Dostawa tlenu jest krytyczna. 
Ponieważ mózg wymaga dużej ilości tlenu 22, procedura krojenia musi być szybka (im bardziej czas trwania kroków 3.1-3.10 zbliża się do ~5-6 minut, tym lepiej dla zachowania zdrowia tkanki).</li>
<li>SCN jest wrażliwe na zmiany temperatury i wymianę medium. 
SCN jest wrażliwe na temperaturę, a duże zmiany temperatury mogą spowodować przesunięcie fazy rozrusznika i wywołać artefakty eksperymentalne 23. Jeśli podczas trwającego eksperymentu wymieniane są lub dodawane media bądź roztwory, na przykład podczas podawania leku po kilku dniach hodowli, medium lub roztwór musi zostać uprzednio podgrzany do 36-37°C (tej samej temperatury, co w komorze) przed dodaniem. W eksperymentach farmakologicznych obejmujących wymiany mediów ważne jest, aby zawsze pracować z uprzednio kondycjonowanym medium do hodowli komórkowej. Dodanie lub wypłukanie świeżym, niekondycjonowanym medium może potencjalnie przesunąć fazę molekularnego rytmu SCN 24, jak i rytmów w hodowlach innych typów komórek 25.</li>
<li>Skład medium. 
Ważne jest, aby hodować tkankę przy prawidłowym pH i osmolalności. Medium buforowane powietrzem zawiera dużą ilość HEPES, który ma optymalną pojemność buforową w zakresie pH 6.8-8.2 i nadaje się również do buforowania zmian pH, które mogą wystąpić w wyniku oddychania komórkowego. HEPES z kolei jest bardziej wrażliwy na zmiany temperatury w porównaniu z wodorowęglanem sodu, który jest zawarty w niewielkich ilościach w medium hodowlanym. Wodorowęglan sodu ma większą pojemność buforową w niższym zakresie pH (5.1-7.1) 26, przez co jest odpowiedni w atmosferze CO2. Jednak zwiększenie ilości wodorowęglanu sodu w medium buforowanym powietrzem (DMEM 2902) znacząco zwiększa osmolalność i nie może być dodawane bez jednoczesnego rozcieńczania medium, co z kolei prowadzi do nieprawidłowego składu aminokwasów, witamin i jonów. 
Wskazówki dotyczące przygotowania medium:
<ol>
<li>Należy być precyzyjnym i ostrożnym podczas mieszania medium.</li>
<li>Należy używać tylko świeżych lub świeżo rozmrożonych roztworów stokowych.</li>
<li>W przypadku bardzo wysokiej osmolalności nie warto rozcieńczać medium. Medium rozcieńczone o więcej niż 5-6% najprawdopodobniej nie będzie działać. W przypadku zbyt niskiej osmolalności należy użyć D-glukozy, aby ją zwiększyć.</li>
</ol>
</li>
<li>Przesunięcia fazy wynikające z czasu przygotowania 
Czas przygotowania skrawka jest krytyczny. Zerowy lub minimalny wpływ na fazę uzyskuje się, jeśli procedura krojenia jest przeprowadzana między ZT 6-12 12. Wszystkie sekcje skrawków powinny być wykonywane w tej samej fazie cyklu dobowego lub okołodobowego, aby zminimalizować błąd wynikający z różnic w fazie między preparatami.</li>
</ol>
Możliwe modyfikacje
<ol>
<li>W przypadku ostrej elektrofizjologii SCN, przygotowanie przekrojów musi odbywać się w buforze Ringera (Sztuczny Płyn Mózgowo-Rdzeniowy; ACSF), nasyconym tlenem (95% O2, 5% CO2) przed rozpoczęciem procesu cięcia. Ponadto tlen musi być stale dostarczany do buforu przez całą procedurę przygotowywania przekrojów, ponieważ aktywność elektryczna i synaptyczna jest bezpośrednio zależna od dostaw tlenu 22.</li>
<li>Z SCN można również z powodzeniem przygotować i hodować przekroje poziome oraz strzałkowe. Autorzy posiadają doświadczenie w rejestracji lucyferazy w przekrojach poziomych, które według naszych obserwacji wykazują oscylacje okołodobowe o niższej amplitudzie w porównaniu do cięć czołowych.</li>
<li>SCN ma długość około 1 mm w osi rostro-kaudalnej, a opisana tutaj technika cięcia jest ukierunkowana na uzyskanie sekcji SCN z regionu centralnego. Niemniej jednak z mózgów myszy i szczurów można uzyskać więcej niż jedną sekcję SCN, co pozwala na badanie ekspresji genów/białek okołodobowych na poziomach bardziej rostralnych i kaudalnych jądra SCN.</li>
<li>Można również przygotować hodowle z przekrojów młodych zwierząt, szczeniąt urodzonych po okresie prenatalnym, a nawet embrionów. Należy pamiętać, że mózg i czaszka bardzo młodych szczeniąt są bardzo miękkie i wrażliwe. Ponadto nerw wzrokowy jest cienki i nie w pełni rozwinięty. Należy zachować ostrożność podczas preparowania mózgu szczeniąt, aby nie uszkodzić obszaru SCN. Na przykład mikro-kleszczyków kostnych nie można stosować do otwierania czaszki szczeniąt myszy, ponieważ są one zbyt duże. Do przecięcia miękkich tkanek u młodych szczeniąt wystarczają precyzyjne nożyczki.</li>
<li>Opisana tutaj technika hodowli na szkiełkach podstawowych może być również wykorzystana do obrazowania luminescencji przy użyciu kamery CCD/EM-CCD, w tym w pojedynczych neuronach SCN.</li>
<li>Inne regiony ośrodkowego układu nerwowego oraz tkanki narządów obwodowych od zwierząt transgenicznych PER2::LUC mogą być łatwo pozyskiwane, hodowane i analizowane pod kątem oscylacji molekularnych, ponieważ ekspresja PER2::LUC oscyluje przez wiele dni również w wielu innych tkankach i typach komórek 10. Większość tych tkanek obwodowych, na przykład wątroba, nie wymaga membrany do przeżycia, lecz są hodowane poprzez bezpośrednią kąpiel w medium 11. Proszę pamiętać, że przesunięcie fazy wynikające z sekcjonowania, hodowli i wymiany medium może nie przebiegać zgodnie z tymi samymi zasadami, co w przypadku SCN.</li>
</ol>
Znaczenie
W transgenicznych szczepach myszy i szczurów (mPER2::LUC; mPer1-luc 8, 10, 27) aktywność enzymu lucyferazy odzwierciedla rytmy ekspresji białek lub genów i może być oceniana za pomocą rejestracji bioluminescencji. Bioluminescencja generowana przez lucyferazę daje słaby sygnał, ale luminescencja tła jest bliska zeru, co czyni tę metodę korzystną. Ponadto, ponieważ cząsteczka lucyferazy jest niestabilna i ulega szybkiej degradacji, nie występuje fototoksyczność, która może pojawić się podczas długotrwałego naświetlania pobudzającego 28. Sumarycznie właściwości te pozwalają na prowadzenie długofalowych eksperymentów, co sprawia, że technologia reporterowa oparta na lucyferazie jest bardzo korzystna w badaniach nad rytmami okołodobowymi.

<table><tbody><tr><td>Suplement B27 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka coverglass</td><td>Menzel-Glaser</td><td>40#1</td><td>&amp;#8776; 40 mm</td></tr><tr><td>Membrany hodowlane</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG50</td><td>0.4 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>DMEM z niską zawartością glukozy bez czerwieni fenolowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2902</td><td>Proszek na 1L</td></tr><tr><td>Papier filtracyjny</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1003 055</td><td>&amp;#8776; 55 mm</td></tr><tr><td>Zestaw do filtracji</td><td>Corning</td><td>431097</td><td>Wielkość porów 0.22 &amp;#x03BC;m, polietersulfon</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>0203-7-PS</td><td>Dumant #7</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Invitrogen</td><td>14065-049</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>NaOCH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 7.5%</td><td>Invitrogen</td><td>25080-060</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Lucyferyna</td><td>Promega Corp.</td><td>E1602</td><td>Lucyferyna świetlikowa, sól potasowa</td></tr><tr><td>Mikro-kumer krawędziowy</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>332-097-140</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep 10 000 U/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>&amp;#8776; 35 mm</td></tr><tr><td>PMT</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>H9319-11MOD</td><td></td></tr><tr><td>Skalpele jednorazowe</td><td>Paragon</td><td>P503</td><td>Rozmiar 11</td></tr><tr><td>Filtr próżniowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-5</td><td></td></tr><tr><td>Smar próżniowy</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>50 g</td></tr><tr><td>Wibrotom</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie skrawków, organotypowe hodowanie tkanek i rejestracja aktywności genów zegarowych za pomocą lucyferazy w jądrze nadskrzyżowaniowym

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Centralny zegar okołodobowy (~24 h) koordynujący dzienne rytmy fizjologiczne i behawioralne znajduje się w jądrach nadskrzyżowaniowych (SCN) zlokalizowanych w przedniej części podwzgórza. Zegar ten jest bezpośrednio synchronizowany przez światło za pośrednictwem siatkówki i nerwu wzrokowego. Oscylacje okołodobowe są generowane przez oddziałujące na siebie pętle ujemnego sprzężenia zwrotnego szeregu tzw. „genów zegarowych” i ich produktów białkowych, w tym genów Period (Per). Główny mechanizm zegara zależy również od depolaryzacji błony, wapnia oraz cAMP 1. SCN wykazuje codzienne oscylacje w ekspresji genów zegarowych, aktywności metabolicznej i spontanicznej aktywności elektrycznej. Co istotne, ta endogenna aktywność cykliczna utrzymuje się w skrawkach tkanek SCN pobranych od dorosłych osobników 2-4. W ten sposób zegar biologiczny można łatwo badać in vitro, co umożliwia molekularne, elektrofizjologiczne i metaboliczne analizy funkcji rozrusznika.
jądro nadskrzyżowate (SCN) jest małą, wyraźnie zdefiniowaną strukturą obustronną, zlokalizowaną bezpośrednio nad skrzyżowaniem wzrokowym 5. U szczura każde jądro zawiera około 8000 neuronów i ma wymiary około 947 μm (długość, oś rostrokaudalna) x 424 μm (szerokość) x 390 μm (wysokość) 6. Aby wypreparować SCN, konieczne jest wykonanie przekroju mózgu na konkretnym poziomie, na którym można zidentyfikować SCN. W niniejszej pracy opisujemy procedurę preparowania i krojenia SCN, która jest podobna dla mózgów myszy i szczura. Ponadto pokazujemy, jak hodować wypreparowaną tkankę organotypowo na membranie 7, technikę opracowaną dla hodowli tkanki SCN przez Yamazaki et al. 8. Na koniec demonstrujemy, w jaki sposób tkanka transgeniczna może być wykorzystana do pomiaru ekspresji genów/białek zegarowych z wykorzystaniem dynamicznej technologii reportera lucyferazy, metody pierwotnie stosowanej do pomiarów okołodobowych przez Geusz et al. 9. Wykorzystujemy tutaj tkanki SCN z transgenicznych myszy knock-in PERIOD2::LUCIFERASE stworzonych przez Yoo et al. 10. Myszy te zawierają białko fuzyjne PERIOD (PER) 2 i enzym LUCIFERASE z świetlika. Gdy PER2 jest translacyjny w obecności substratu dla lucyferazy, tj. lucyferyny, ekspresję PER2 można monitorować jako bioluminescencję, gdy lucyferaza katalizuje utlenianie lucyferyny. Liczba emitowanych fotonów koreluje dodatnio z ilością wyprodukowanego białka PER2, a rytmy bioluminescencji odpowiadają rytmowi białka PER2 in vivo 10. W ten sposób cykliczne zmiany w ekspresji PER2 mogą być stale monitorowane w czasie rzeczywistym przez wiele dni. Protokół, który stosujemy w hodowli tkanek i rejestracji bioluminescencji w czasie rzeczywistym, został szczegółowo opisany przez Yamazaki i Takahashi 11.

Opisano procedurę przygotowania skrawków zawierających jądro nadskrzyżowaniowe (SCN) podwzgórza dorosłej myszy oraz szybką metodę hodowli tkanki SCN w warunkach hodowli organotypowej. Ponadto opisano pomiar oscylacyjnej ekspresji białek genów zegarowych z wykorzystaniem dynamicznej technologii reporterowej lucyferazy.

Przygotowanie skrawków, organotypowe hodowanie tkanek i rejestracja aktywności genów zegarowych za pomocą lucyferazy w jądrze nadskrzyżowaniowym

Centralny zegar okołodobowy (ok. 24 godz.), koordynujący codzienne rytmy fizjologiczne i behawioralne, znajduje się w jądrach nadskrzyżowaniowych (SCN) zlokalizowanych w...

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie sposobu krojenia i wyizolowania jądra nadskrzyżowaniowego z myszy transgenicznych oraz hodowli tkanki jądra nadskrzyżowaniowego w celu rejestracji ekspresji genu lub białka zegarowego jako luminescencji indukowanej przez lucyferazę. Cel ten osiąga się poprzez wyizolowanie mózgu z myszy transgenicznej zawierającej reporter lucyferazowy dla genu lub białka zegarowego, a następnie wykonanie przekroju mózgu zawierającego jądro nadskrzyżowaniowe. Drugim krokiem procedury jest wyizolowanie małych, obustronnych jąder nadskrzyżowaniowych z wykonanego przekroju.Trzecim krokiem procedury jest hodowla schematycznego eksplantu jądra na membranie w płytce Petriego zawierającej pożywkę hodowlaną i lucyferynę. Ostatnim krokiem procedury jest rejestracja aktywności lucyferazy poprzez pomiar bioluminescencji za pomocą fotopowielaczy w szczelnej od światła, podgrzewanej komorze. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące oscylacje okodobowe genu lub białka zegarowego.Nazywam się Sergey IV i pracuję w klubie Gabrielle Re. Nazywam się SoFi Johansson i pracuję w zespole Gabrielli. Nazywam się Gabriel Quist.Jestem głównym badaczem w Departamencie Neuronauk, a moje nazwisko to Ka LaShon; jestem doktorantką w Szwedzkim Centrum Neuronauk Medycznych i współpracuję z Gabrielą. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak Western Blot, RT-PCR i hybrydyzacja in situ, jest możliwość ciągłego śledzenia ekspresji genu lub białka zegarowego przez wiele dni w tej samej tkance z bardzo wysoką rozdzielczością wynoszącą około jednej minuty, co pozwala na szczegółową analizę okresu, amplitudy i fazy rytmu okołodobowego. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy cięcia i sekcji tkanek są trudne do opanowania.SEN jest bardzo mały i może być trudny do zidentyfikowania. Procedurę zademonstruje dr Sge Velia, stażysta postdoktorski w moim zespole badawczym. Po przygotowaniu niezbędnych roztworów, należy przygotować płytki Petriego, które zostaną użyte w eksperymencie, używając strzykawki o pojemności five milliliter wypełnionej wcześniej smarem próżniowym do autoklawów.Nanieś smar na górną powierzchnię pierścienia 35 milimetrowej szalki Petriego. Przygotuj oddzielną szalkę Petriego dla każdego plasterka kultury. Napełnij probówkę Falcon 10 mililitrami buforowanej pożywki hodowlanej.Pozwoli to na przygotowanie wystarczającej ilości pożywki dla ośmiu kultur. Dodaj 10 µL świeżo rozmrożonego lucyferianu. Lucyferian jest wrażliwy na światło, dlatego należy chronić pożywkę z lucyferianem przed światłem, przechowując probówkę Falcon w ciemnej komorze inkubacyjnej o temperaturze 37 °C.Następnie wysterylizuj wszystkie instrumenty, szkiełka nakrywki oraz inne materiały wykorzystywane w procedurze. Spryskaj cały niesterylny sprzęt 70% ethanol. Naświetlaj instrumenty oraz nasmarowane szalki Petriego promieniami UV w sterylnej komorze przez co najmniej 30 minut.Kolejnym krokiem przygotowawczym jest ustawienie wibratomu i przymocowanie sterylnego ostrza żyletki. Sprzęt jest teraz przygotowany do procedury chirurgicznej. Po znieczuleniu i dekapitacji myszy, należy usunąć gałki oczne z głowy za pomocą nożyczek.Zapobiega to trenowaniu lub pobudzaniu nerwów wzrokowych, co pomaga uniknąć uszkodzenia jądra nadskrzyżowaniowego (SCN). Za pomocą precyzyjnych nożyczek usuń ostatni kręg szyjny oraz skórę. Wykonaj dwa nacięcia w kości czaszki wzdłuż obu jej stron, tworząc w ten sposób usuwalną klapkę.Otwórz czaszkę za pomocą narzędzia micro Rongeur. Używaj narzędzia, wykonując ruchy w górę, nigdy nie naciskając nim na mózg. Aby zapobiec uszkodzeniu jądra nadskrzyżowaniowego (SCN), usuwaj kość aż do momentu, gdy widoczne staną się opuszki węchowe.Za pomocą precyzyjnych nożyczek mikrodysekcyjnych ostrożnie przetnij nerw wzrokowy pomiędzy półkulami a opuszkami węchowymi. Umieść płytkę Petriego wypełnioną 50 do 100 mililitrów zimnego HBSS pod głową myszy. Odwróć głowę do góry dnem, aby nienaruszony mózg mógł swobodnie wypaść.Przeciąć pozostałe nerwy czaszkowe w razie potrzeby po stronie przeciwnej do nerwu wzrokowego. Po oddzieleniu mózg wpada do szalki Petriego, co powoduje jego szybkie schłodzenie. Za pomocą łyżki przenieść lodowaty mózg na sterylną powierzchnię do cięcia, taką jak odwrócona do góry dnem pokrywka szalki Petriego.Usunąć móżdżek, wykonując prostopadłe cięcie sterylnymi żyletkami pomiędzy półkulami a móżdżkiem. Nanieść superglue na suchą platformę urządzenia. Wprowadzić ostre zakrzywione pęsety w części rostralnej mózgu i uchwycić mózg, trzymając go za pomocą pęset.Ostrożnie osusz HBSS za pomocą sterylnego papieru filtracyjnego. Przymocuj półkule do kleju na platformie, kierując wierzchołek rostralny do góry, a powierzchnię brzuszną najbliżej ostrza tnącego. Umieść platformę w uchwycie wibrotomu i natychmiast wypełnij go zimnym HBSS.Jeśli cięcie prostopadłe zostało wykonane prawidłowo, półkule powinny stać pionowo. Celem jest wykonanie przekrojów wieńcowych obejmujących środkowy region obustronnych SCN, przy użyciu maksymalnej prędkości wibratomu. Należy odcinać sekcje półkul o grubości od 500 do 800 mikrometrów, aż do osiągnięcia commissary. Obserwuj.W miarę jak skrzyżowanie wzrokowe staje się szersze, przy jednoczesnym zmniejszeniu grubości przekrojów do 100 µm, kontynuuj krojenie w kierunku brzuszno-grzbietowym, spowalniając poziomy ruch ręczny noża, aż zaczną pojawiać się dwa jądra SCN. W razie potrzeby użyj lupy, aby zwizualizować jądra po osiągnięciu poziomu SCN. Wykonaj przekrój SCN o grubości 250 µm.Napełnij pokrywkę od średniej wielkości szalki Petriego zimnym roztworem HBSS, używając miękkiego pędzla. Podnieś i przenieś przekrój mózgu SCN do szalki Petriego. Umieść szalkę Petriego pod stereomikroskopem.Kolejnym krokiem jest wycięcie SCN z preparatu. Za pomocą mikroskopu należy zweryfikować, czy obustronne SCN są wyraźnie widoczne przynajmniej po jednej stronie przekroju. Używając pary sterylnych skalpeli, należy wyciąć kwadrat tkanki o boku około 1,5 mm, zawierający oba SCN.Przetnij tkankę jak najbliżej SCN. Bez usuwania tkanki SCN należy do preparatu dołączyć niewielki fragment nerwu wzrokowego, jednak nie powinny zostać uwzględnione żadne inne jądra. Przetnij tkankę zawierającą obustronne SCN na pół, aby uzyskać dwa jednostronne SCN.Jeden jednostronny SCN może służyć jako kontrola w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przy wyłączonym świetle należy dodać 1200 µL medium Lucifer do szalki Petriego o średnicy 35 mm, a następnie umieścić membranę hodowlaną na powierzchni cieczy. Należy upewnić się, że pod membraną nie ma pęcherzyków powietrza.Implantaty są bardzo małe i trudne do podniesienia. Dlatego należy użyć pipety 1000 µL z końcówką, aby zassać eksplant SEN do końcówki, a następnie wycisnąć go na membranę hodowlaną. Usunąć nadmiar HBSS przed pomiarem lucyferazy; w każdej szalce Petriego należy umieścić tylko jeden SEN.Uszczelnij szalkę Petriego z tłuszczem szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 40 mm. Dodaj więcej tłuszczu, jeśli uszczelnienie nie jest szczelne. Przenieś szalki Petriego do aparatury aluma cycle umieszczonej w zaciemnionej komorze grzewczej o temperaturze od 36 do 37 °C.Aby rozpocząć hodowlę, należy zwrócić uwagę na naczynia hodowlane oraz zestawy detektorów z lampą fotopowielaczową zamontowane wewnątrz komory cyklu lum. Naczynia hodowlane należy umieścić około jednego do dwóch centymetrów poniżej lamp fotopowielaczowych. Lampy fotopowielaczowe wykrywają i wzmacniają sygnał lucyferazy indukowany luminescencją.Oprogramowanie Luma Cycle służy do akwizycji danych. Liczbę fotonów integruje się w odstępach od jednej do 10 minut, aby uzyskać wysoką rozdzielczość ekspresji białka genu. Analizuje się okołodobową ekspresję białka genu, aby określić fazę, okres i amplitudę rytmu.Rysunek ten przedstawia zapisy bioluminescencji z hodowli tkanek SCN zdrowych i niezdrowych. Myszy te były utrzymywane w cyklu 12 godzin światła i 12 godzin ciemności przed pobraniem tkanki SCN. Czarna linia obrazuje rytm dobowy zapisów bioluminescencji ekspresji lucyferazy period dwa.W zdrowym plastrze SEN białko oscyluje zgodnie z rytmem dobowym, w którym maksymalna ekspresja białka występuje w czasie ze gaber, między 12 a 13 godziną lub na początku ciemności. Zatem faza rytmu genu zależy od harmonogramu cyklu światło-ciemność, w którym zwierzę przebywało przed uśmierceniem. Niebieska linia przedstawia pomiary bioluminescencji z kultury SE, która wyschła po otwarciu naczynia hodowlanego w czwartym dniu, co zaznaczono strzałką, z powodu nieprawidłowego zamknięcia.Czerwona linia przedstawia zapisy bioluminescencji z niezdrowej hodowli SCN. Rysunek ten obrazuje zastosowanie hodowli SCN w eksperymencie farmakologicznym. Na rysunku widoczny jest zapis z hodowli, która została poddana działaniu blokera kanałów jonowych HCN w czasie wskazanym przez pierwszą strzałkę.W ciągu dwóch do trzech dni bloker kanałów jonowych zmniejszył, a następnie zatrzymał oscylację okołodobową w miejscu wskazanym przez drugą strzałkę. Podczas wykonywania tej procedury lek wypłukano i zastąpiono kondycjonowaną pożywką kontrolną. Należy pamiętać o szybkim, lecz ostrożnym działaniu, aby zachować żywotność tkanki SEN.Ważne jest również ustandaryzowanie sekcjonowania w wibrotomie, aby za każdym razem uzyskać ten sam poziom SEN. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak kroić i preparować kulturę SEN oraz organ SCN, zazwyczaj na membranie, a także jak monitorować ekspresję genów lub białek zegarowych jako luminescencję indukowaną lucyferazą w kulturach.

slice-preparation-organotypic-tissue-culturing-luciferase-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przygotowanie kawałków tkanek, hodowla tkankowa organotypowa i rejestrowanie aktywności genów zegara za pomocą luciferase w jądrze nadskrzyżowania wzrokowego

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania i utrzymania preparatu przekroju nowokory w kulturze organotypowej w celu wykonania rejestracji elektrycznej z neuronów piramidowych.

Rejestracja całokomórkowa z organotypowego preparatu skrawka neokory

Zegary okołodobowe funkcjonują w obrębie poszczególnych komórek, tzn. są autonomiczne komórkowo. W niniejszej pracy opisujemy metody tworzenia autonomicznych komórkowo modeli zegara z wykorzystaniem nieinwazyjnej technologii bioluminescencji w czasie rzeczywistym opartej na lucyferazie. Komórki reporterowe stanowią praktyczne, funkcjonalne systemy modelowe do badania biologii okołodobowej.

Monitorowanie komórkowych autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji genów z wykorzystaniem reporterów bioluminescencyjnych lucyferazy

Źródło: Sabado, V., et al.,  }Nagoshi, E. Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki Drosophila Zegary okołodobowe w mózgu larw Kultura. J. Vis. exp. (2018).  Ten film demonstruje procedurę osadzania mózgu  Drosophila{} w matrycy fibryny, a następnie obrazowanie fluorescencyjne poklatkowe neuronów zegara okołodobowego w celu analizy rytmicznej aktywności zsynchronizowanej z cyklami światła/ciemności.

Osadzenie mózgu Drosophila w matrycy w celu obrazowania poklatkowego neuronów zegara okołodobowego

Procedury są opisane w celu jednoczesnego rejestrowania potencjału błonowego lub prądu oraz zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Neurony jądra nadskrzyżowaniowego są wypełnione wskaźnikiem wapnia bis-fura-2 za pomocą elektrody patch clamp w konfiguracji patch clamp całej komórki.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadskrzyżowaniowego

Zegar okołodobowy reguluje około jednej trzeciej transkryptomu Arabidopsis, ale procent genów, które wracają do pomiaru czasu, pozostaje nieznany. Tutaj wizualizujemy metodę szybkiej oceny fenotypów okołodobowych w dowolnej zmutowanej linii Arabidopsis przy użyciu obrazowania luminescencyjnego reportera okołodobowego przejściowo ulegającego ekspresji w protoplastach.

Szybka analiza fenotypów okołodobowych w protoplastach Arabidopsis transfekowanych zegarem luminescencyjnym

Tutaj opisujemy ustawienia do równoległego monitorowania bioluminescencji okołodobowej i aktywności wydzielniczej ludzkich komórek wysp trzustkowych i pierwotnych miotub. W tym celu zastosowaliśmy dostarczanie genu lentiwirusowego za pomocą reportera zegara rdzeniowego lucyferazy, a następnie synchronizację in vitro i zbieranie pożywki odpływowej przez ciągłą peryfuzję komórek.

Równoległy pomiar ekspresji genów zegara okołodobowego i wydzielania hormonów w pierwotnych hodowlach komórkowych człowieka

Ta nowo opracowana technologia oparta na fluorescencji umożliwia długoterminowe monitorowanie transkrypcji genów zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN) swobodnie poruszających się myszy w czasie rzeczywistym i w wysokiej rozdzielczości czasowej.

In vivo (in vivo) Monitorowanie ekspresji genu zegara okołodobowego w jądrze nadskrzyżowaniowym myszy za pomocą reporterów fluorescencyjnych

Celem tego protokołu jest stworzenie ex vivo hodowli mózgu larw Drosophila zoptymalizowanej do monitorowania okołodobowych rytmów molekularnych za pomocą długoterminowego fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego. Omówiono również zastosowanie tej metody do testów farmakologicznych.

Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw

Neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe wykazują różną dynamikę ekspresji komponentów sygnalizacyjnych Notch, które prowadzą do różnych wyników zdarzeń komórkowych. Taką dynamiczną ekspresję można ujawnić poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym, a nie przez analizę statyczną, przy użyciu bardzo czułego systemu obrazowania bioluminescencyjnego, który umożliwia wizualizację szybkich zmian w ekspresji genów.

Obrazowanie bioluminescencyjne w czasie rzeczywistym dynamiki sygnalizacji Notch podczas neurogenezy myszy

Rytmy okołodobowe, które istnieją w większości organizmów, regulują czasową organizację organoidów biologicznych processes. 3D ostatnio pojawiły się jako fizjologicznie istotny model in vitro. Protokół ten opisuje zastosowanie bioluminescencyjnych reporterów do obserwacji rytmów okołodobowych w organoidach, umożliwiając badania in vitro rytmów okołodobowych w układach wielokomórkowych.

Monitorowanie oscylacji okołodobowych za pomocą reportera bioluminescencji w organoidach

Raport opisuje metodę wykorzystującą skrypt R w otwartym oprogramowaniu RStudio do analizy dużych zbiorów danych uzyskanych z eksperymentów z szeregami czasowymi.

Przyjazna użytkownikowi i wydajna analiza R dużych zbiorów danych

Poznaj metodę preparowania plastrów jądra nadskrzyżowaniowego myszy transgenicznej i hodowlę organotypową z rejestracją aktywności genu zegara przy użyciu lucyferazy.

Przygotowanie plastrów, organotypowa hodowla tkanek i rejestracja aktywności genu zegara w jądrze nadskrzyżowaniowym za pomocą lucyferazy (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie skrawków, organotypowe hodowanie tkanek i rejestracja aktywności genów zegarowych za pomocą lucyferazy w jądrze nadskrzyżowaniowym

Przeglądaj więcej filmów