Przygotowanie plastrów, organotypowa hodowla tkanek i rejestracja aktywności genu zegara w jądrze nadskrzyżowaniowym za pomocą lucyferazy

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, jak pokroić i wypreparować jądro nadmatyczne od myszy transgenicznych oraz wyhodować schematyczną tkankę w celu zarejestrowania ekspresji genu zegarowego lub białka jako lucyferazy indukowanej luminescencją. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie mózgu transgenicznej myszy, która zawiera reporter lucyferazy dla genu zegara lub białka, a następnie wykonanie wycinka mózgu zawierającego jądro nadmatyczne. Drugim etapem procedury jest wypreparowanie małych obustronnych schematycznych jąder z wycinka.

Trzecim etapem procedury jest wyhodowanie schematycznego jądra na błonie na szalce Petriego, która zawiera kulturę, pożywkę i lucyferian. Ostatnim etapem procedury jest rejestracja aktywności lucyferazy poprzez pomiar bioluminescencji za pomocą probówek fotopowielacza w światłoszczelnej, ogrzewanej komorze. Ostatecznie można uzyskać wyniki, w których wybrano oscylację okołodobową genu zegara lub białka.

Nazywam się Sergey IV i pracuję w klubie Gabrielle Re. Nazywam się SoFi Johansson i pracuję w zespole Gabrielli. Nazywam się Gabriel Quist.

Jestem głównym badaczem na Wydziale Neuronauki, nazywam się Ka LaShon, jestem doktorantem w Szwedzkim Centrum Neuronauki Medycznej i współpracuję z Gabriellą. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak Western Blot R-T-P-C-R, oraz dwie hybrydyzacje jest to, że ekspresja genu zegarowego lub białka może być śledzona w sposób ciągły przez wiele dni w tej samej tkance z bardzo wysoką rozdzielczością około jednej minuty, co pozwala na szczegółową analizę amplitudy okresu i oblicza rytmu okołodobowego. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy krojenia i sekcji SEN są trudne do nauczenia.

Wskaźnik SEN jest bardzo mały i może być trudny do zidentyfikowania. Procedurę zademonstruje dr Sge Velia, adiunkt w moim zespole badawczym. Po sporządzeniu niezbędnych roztworów przygotuj szalki Petriego, które zostaną użyte w eksperymencie, za pomocą pięciomililitrowej strzykawki wypełnionej smarem próżniowym w autoklawie.

Nałóż smar na górną powierzchnię pierścienia 35-milimetrowej szalki Petriego. Przygotuj osobną szalkę Petriego dla każdego plasterka. Kultura. Napełnij probówkę Falcon 10 mililitrami pożywki powietrznej, buforowanej pożywki hodowlanej.

To wystarczy, aby pożywka wystarczyła dla ośmiu kultur. Dodaj 10 mikrolitrów świeżo rozmrożonego lucyferianu. Lucyferian jest wrażliwy na światło, więc chroń ośrodek lucyferyczny przed światłem, przechowując rurkę Falcona w ciemnej komorze grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie wysterylizuj wszystkie narzędzia, okulary nakrywkowe i inne materiały, które mają być użyte w zabiegu. Spryskaj wszystkie niesterylne urządzenia 70% etanolem. Wystawić narzędzia i natłuszczone szalki Petriego na działanie promieniowania UV w sterylnym kapturze przez co najmniej 30 minut.

Kolejnym krokiem przygotowawczym jest ustawienie vibrato i przymocowanie sterylnej żyletki. Sprzęt jest teraz przygotowany do zabiegu chirurgicznego. Po znieczuleniu i odcięciu głowy myszy usuń oczy z głowy za pomocą nożyczek.

Zapobiega to treningowi lub pobudzaniu nerwów wzrokowych, co pomaga uniknąć uszkodzenia schematycznego jądra lub SCN. Użyj cienkich nożyczek, aby usunąć ostatni kręg szyjny i usunąć skórę. Wykonaj dwa nacięcia w kości czaszki po obu stronach czaszki, tworząc w ten sposób zdejmowaną pokrywę.

Otwórz czaszkę za pomocą mikronarzędzia Ron Jré. Używaj RJ ruchem w górę, nigdy nie naciskając narzędziem na mózg. Aby zapobiec uszkodzeniu SCN rozpieszcza, usuń całą kość, aż będzie widać opuszki węchowe.

Użyj cienkich mikronożyczek sprężynowych, aby ostrożnie przeciąć nerw wzrokowy między półkulami a opuszkami węchowymi. Proszę. Szalka Petriego wypełniona od 50 do 100 mililitrami zimnego HBSS pod głową myszy. Odwróć głowę do góry nogami i pozwól, aby nienaruszony mózg zaczął wypadać.

W razie potrzeby wytnij inne nerwy czaszkowe po przeciwnej stronie nerwu wzrokowego. Po odłączeniu mózg wpada na szalkę Petriego, która szybko chłodzi mózg. Użyj łyżki, aby przenieść lodowaty mózg na sterylną powierzchnię cięcia, taką jak szklana pokrywka szalki Petriego odwrócona do góry nogami.

Usuń móżdżek, wykonując prostopadłe cięcie sterylnymi żyletkami między półkulami a móżdżkiem. Nałóż superglue na suchą platformę viome. Włóż ostre, zakrzywione kleszcze do rostralnej części mózgu i podnieś mózg, trzymając mózg kleszczami.

Ostrożnie wysusz HBSS na sterylnej bibule filtracyjnej. Przymocuj półkule do kleju na platformie końcówką rostralną do góry i powierzchnią brzuszną najbliżej ostrza tnącego. Przymocuj platformę do uchwytu vibrato i natychmiast napełnij ją zimnym HBSS.

Jeśli prostopadłe cięcie zostanie wykonane prawidłowo, półkule powinny stać prosto do góry. Celem jest przecięcie wycinków koronalnych zawierających środkowy obszar obustronnego SCN, przy użyciu maksymalnej prędkości vibrato. Zacznij odcinać odcinki półkul o grubości od 500 do 800 mikrometrów, aż do osiągnięcia spoidła. Zegarek.

W miarę poszerzania się skrzyżowania optycznego, któremu towarzyszy redukcja odcinków do grubości 100 mikrometrów, kontynuuj krojenie w kierunku rozpieszczania, spowalniając poziomy ruch ręczny ostrza, aż zaczną pojawiać się dwa jądra SCN. W razie potrzeby użyj szkła powiększającego, aby uwidocznić jądra, gdy poziom SCN zostanie osiągnięty. Wytnij odcinek SCN o długości 250 mikrometrów.

Napełnij pokrywkę średniej wielkości szalki Petriego zimnym HBSS za pomocą miękkiej szczoteczki. Podnieś i przenieś sekcję mózgu SCN na szalkę Petriego. Umieścić szalkę Petriego pod mikroskopem preparacyjnym.

Następnym krokiem jest wycięcie SCN z wycinka. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy obustronny SCN jest wyraźnie widoczny z co najmniej jednej strony przekroju. Użyj pary sterylnych skalpeli, aby wyciąć kwadrat tkanki, około 1,5 milimetra z każdej strony, zawierający oba SCN.

Przyciąć jak najbliżej SCN. Bez usuwania tkanki SCN mały fragment nerwu wzrokowego musi być przymocowany do eksplanu, ale żadne inne jądra nie powinny być dołączone. Przeciąć tkankę zawierającą obustronny SCN na pół, aby uzyskać dwa jednostronne SCN.

Jeden jednostronny SCN może być używany jako kontrola w sterylnym kapturze. Przy wyłączonym świetle dodaj 1200 mikrolitrów pożywki Lucyfera do szalki Petriego o średnicy 35 milimetrów, a następnie umieść błonę hodowlaną na powierzchni cieczy. Upewnij się, że pod membraną nie ma pęcherzyków powietrza.

Implanty są małe i trudne do pobrania. Dlatego za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów z końcówką należy zassać SEN explan do końcówki i wycisnąć go na membranę hodowlaną. Odrzuć nadmiar HBSS do zapisu lucyferazy, umieszczając tylko jeden SEN na szalkę Petriego.

Uszczelnij smarowaną szalkę Petriego szkłem nakrywkowym o średnicy 40 milimetrów. Dodaj więcej smaru, jeśli uszczelka nie jest szczelna. Przenieść szalki Petriego do aparatu do cyklu aluma umieszczonego w szczelnej komorze grzewczej o temperaturze od 36 do 37 stopni Celsjusza.

Aby rozpocząć hodowlę, zwróć uwagę na szalki hodowlane i zespoły detektorów lampy fotopowielacza zamontowane w komorze cyklu lum. Umieść szalki hodowlane poniżej rurek fotopowielacza na około jeden do dwóch centymetrów. Lampy fotopowielacza wykrywają i wzmacniają lucyferazy indukowaną przez luminescencję.

Do akwizycji danych służy narzędzie programowe Luma Cycle. Zliczanie fotonów jest integrowane w odstępach od jednego do 10 minut, aby uzyskać wysoką rozdzielczość ekspresji białka genu. Okołodobowa ekspresja białka genu jest analizowana w celu określenia okresu fazowego i amplitudy rytmu.

Ten rysunek przedstawia zapisy bioluminescencji ze zdrowych i niezdrowych kultur tkankowych SCN. Myszy te były trzymane w 12 godzinach światła i 12 godzin w ciemności przed usunięciem ich tkanki SCN. linia pokazuje rytm okołodobowy zapisów bioluminescencyjnych ekspresji lucyferazy z drugiego okresu.

W zdrowym wycinku SEN białko oscyluje wraz ze zmiennością okołodobową, w której maksymalna ekspresja białka występuje w czasie gaber, od 12 do 13 lub nadejściu ciemności. Tak więc faza rytmu genów jest zależna od jasnociemnego harmonogramu, w którym zwierzę było trzymane przed złożeniem ofiary. Niebieska linia pokazuje zapisy bioluminescencji z SE i hodowli, które wyschły po otwarciu szalki hodowlanej w czwartym dniu wskazanym strzałką i nie zostały prawidłowo ponownie zamknięte.

Czerwona linia pokazuje nagrania bioluminescencji z niezdrowej hodowli SCN. Na tym rysunku wykorzystano hodowlę SCN w eksperymencie farmakologicznym. Rysunek przedstawia ślad z hodowli, która została potraktowana blokerem kanałów jonowych HCN w czasie wskazanym przez pierwszą strzałkę.

W ciągu dwóch do trzech dni bloker kanału jonowego zmniejszył się, a następnie zatrzymał oscylację okołodobową przy drugiej strzałce. Lek został wypłukany i zastąpiony kondycjonowaną pożywką kontrolną podczas próby tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać o szybkiej, ale ostrożnej pracy, aby utrzymać żywotność tkanki ze SPE.

Ważne jest również, aby ustandaryzować sekcję vibram, aby za każdym razem uzyskiwany był ten sam poziom SEN. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak kroić i preparować kulturę SEN, narząd SCN, zwykle na błonie i monitorować ekspresję genu zegarowego lub białka jako lucyferazy indukowaną przez luminescencję w kulturach.