Obrazowanie poklatkowe segregacji chromosomów u bakterii znakowanych fluorescencją

Zacznij od bogatej w składniki odżywcze agarozowej poduszki na metalowej ramie, zawierającej bakterie wykazujące fluorescencyjne pochodzenie chromosomów oraz fluorescencyjne mikrosfery.

Podkład agarozowy wspiera przyczepianie i mobilność bakterii, a fluorescencyjne mikrosfery służą jako odniesienie do śledzenia segregacji chromosomów.

Dodaj olej immersyjny do soczewki obiektywu w podgrzewanej komorze inkubacyjnej mikroskopu szerokokątnego z odwróconym kątem.

Umieść próbkę nad soczewką, a następnie skup się na obszarze zawierającym wiele bakterii i co najmniej jedną fluorescencyjną mikrosferę.

Rozpocznij obrazowanie poklatkowe i rejestruj zarówno obrazy fazowo-kontrastowe, jak i fluorescencyjne.

Źródło replikacji oznaczone fluorescencją objawia się jasnym skupiskiem blisko jednego końca komórki.

Podczas podziału pierwotne kopie się duplikują; jedna gromada pozostaje na oryginalnym końcu, podczas gdy druga przechodzi do nowo powstałego końca komórki.

Takie rozwiązanie umożliwia śledzenie segregacji chromosomów w wielu podziałach i może być dostosowane do wizualizacji podobnych procesów dynamicznych u innych bakterii, w tym patogennych gatunków podczas interakcji gospodarza.

Aby wykonać mikroskopię poklatkową, włącz mikroskop i uruchom oprogramowanie sterujące mikroskopem. Wybierz odpowiedni obiektyw oraz odpowiednie lustra i filtr, aby uzyskać obrazy z kontrastem fazowym oraz obrazy białek zielonofluorescencyjnych, czerwonofluorescencyjnych lub żółtofluorescencjonalnych. Dodaj kroplę wysokiej jakości oleju immersyjnego na soczewkę obiektywu i na dno próbki wcześniej inkubowanej w 32 stopniach Celsjusza.

Z otworem zwróconym w stronę obiektywu, umieść metalową ramę z próbką na stole mikroskopu, a następnie mocno przymocuj próbkę w uchwytie na podkład. Skup się na komórkach, przesuwając scenę w kierunku Z bliżej celu. Gdy olej na obiektywie i próbce się zetkną, przesuń stopień w kierunku X/Y.

Przełącz się na oprogramowanie Metamorph i otwórz narzędzie Pozyskiwanie. Wybierz Phase Contrast w rozwijanej liście Ustawienia i ustaw czas naświetlania na 100 milisekund. Kliknij Pokaż na żywo, przenieś komórkę do płaszczyzny ogniskowej i przesuń scenę w kierunku X/Y, aż w polu widzenia pojawi się wiele pojedynczych komórek.

Upewnij się, że przynajmniej jedna fluorescencja mikroskopowa znajduje się w obszarze widoku, aby później wyrównać uzyskane obrazy. Następnie otwórz multidimenzjonalnego kreatora akwizycji w oprogramowaniu sterowania mikroskopem, aby przygotować eksperyment poklatkowy, który pozwala mikroskopowi na zbieranie obrazów o różnych długościach fal i pozycjach stopni, jeśli jest to konieczne.

W zakładce głównej aktywuj time-lapse i Multiple Wavelengths. Dodatkowe zakładki pojawią się po lewej stronie okna. Kliknij zakładkę Zapisywanie i wybierz Katalog, aby wybrać pusty folder na dysku twardym komputera i zapisać pobrane obrazy, a następnie aktywuj nazwę bazy Increment If File Exists, aby upewnić się, że kolejne zbiory danych nie nadpisują wcześniejszych. Nadaj eksperymentowi nazwę wraz z datą oraz nazwą szczepu lub tytułem eksperymentu.

Kliknij zakładkę timelapse, aby dostosować parametry timelapse, następnie ustaw Interwał Czasu na 20 minut i ustaw Czas trwania na 24 godziny. Liczba punktów czasu zmienia się automatycznie. Teraz kliknij zakładkę Długości fal.

Wybierz liczbę długości fal, które należy uzyskać dla każdego obrazu w każdym punkcie czasowym, zmieniając tę liczbę. Wybierz Zezwalaj na osobną zapamiętaną pozycję AF dla każdej długości fali. Kliknij zakładkę Pierwsza długość fali od góry.

W rozwijanej liście Oświetlenie wybierz Kontrast fazowy. Wybierz 100 milisekund dla ekspozycji, a w rozwijanej liście Zdobywaj wybierz Każdy punkt czasu. Wyłącz Auto Exposure w rozwijanej liście, wybierając Nigdy i wybierz Każde akwizycje w rozwijanej liście dla Autofocus.

Ustaw ekspozycję dla każdej długości fali, jak właśnie pokazano, używając następujących parametrów. Następnie, aby uzyskać obrazy z wielu pozycji etapu, w zakładce Main aktywuj Wiele Pozycji Etapów. Kliknij zakładkę Stage i kliknij przycisk Live, aby zobaczyć pole widzenia.

Przesuń stopień w kierunku X/Y, aż zwrot z inwestycji znajdzie się w polu widzenia. Zapisz współrzędne X i Y w zakładce Etap, klikając znak plus. Przesuń etap ponownie w kierunku X/Y, aż znajdziesz nowy zwrot z inwestycji, a następnie zapisz współrzędne, klikając znak plus.

Kontynuuj, aż zostanie zapisana pożądana liczba regionów. Sprawdź jeszcze raz, czy komórki są ostre, klikając na różne zapisane pozycje X i Y, a sprzętowe autofokusowanie uruchom klikając AFC hold, aby zachować stałą pozycję Z przez cały eksperyment. Rozpocznij nagrywanie poklatkowe w kreatorze Multi-Dimensional Acquisition w oprogramowaniu sterowania mikroskopem, klikając Acquire.

Sprawdź, czy komórki są nadal ostre po kilku punktach czasowych nagrań time-lapse, aby zmaksymalizować jakość obrazów i w razie potrzeby ponownie się ustawić.