Przetwarzanie zakażonych tkanek do enumeracji bakterii w modelu współinfekcji myszy

Zacznij od myszy współzakażonej patogenną bakterią i wirusem.

Wirus uszkadza błonkową wyściółkę górnych dróg oddechowych myszy, ułatwiając rozprzestrzenianie się bakterii z nosowogardła do płuc.

Umieść pobrane płuca myszy w naczyniu zawierającym sól fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS).

Pokrój płuca na małe kawałki i dobrze wymieszaj.

Przenieś połowę tkanki płucnej do rurki zawierającej PBS.

Umieść sterylizowaną sondę homogenizatora tkanek wewnątrz rurki zawierającej tkankę płucną.

Homogenizuj tkankę, aby uwolnić bakterie do PBS.

Rozcieńcz homogenizację i nakładaj rozcieńczenia na bogatej w składniki odżywcze płytce agarowej.

Inkubuj płytkę, aby umożliwić powstanie kolonii bakteryjnych.

Policz te kolonie, aby ilościowo określić obciążenie bakteryjne płuc, co odzwierciedla obciążenie bakteryjne płuc.

Do pobierania płuc, używając nożyczek do sekcji, przetnij boki odsłoniętej klatki piersiowej i delikatnie pociągnij żebra w stronę głowy myszy, aby odsłonić serce. Do prawej komory włóż igłę o grubości 25 gauge podłączoną do strzykawki 10-mililitrowej z PBS i rozpocznij powolne przetłuszczanie. Zwracaj uwagę na wybielanie płuc jako wskaźnik skutecznej perfuzji.

Płucz powoli, aby nie przełamać tkanki płucnej. Podnieś serce kleszczami i zrób cięcie, aby oddzielić płuca od serca. Po oddzieleniu należy wyjąć wszystkie płatki płuc kleszcze i przepłuczyć w naczyniu sterylnym PBS, aby usunąć resztki krwi.

W misce Petriego pokłóń płuca na małe kawałki i dobrze wymieszaj. Usuń połowę mieszanki płucnej, aby określić bakteryjną CFU lub wirusowe PFU i umieść ją w okrągłej probówce o pojemności 15 mililitrów, wcześniej napełnionej 0,5 mililitra PBS do homogenizacji.

Aby ujednolicić zebraną tkankę, wyczyść sondę homogenizatora, dodając ją do 70% etanolu i włączając homogenizator na 60% mocy przez 30 sekund. Powtórz ten krok w sterylnej wodzie przez 10 sekund.

Ujednolicaj każdą tkankę na 1 minutę. Do wyliczania liczby bakterii, rozcieńczenia seryjne płytki na płytkach agaru krwi. Aby obliczyć całkowity CFU, użyj 10 mikrolitrów do podlewania i zanotuj końcową objętość w mililitrach dla każdej próbki. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.