Name: Zapisy postsynaptyczne w dendrytach aferentnych kontaktujących się z wewnętrznymi komórkami rzęsatymi ślimaka: monitorowanie uwalniania wielopęcherzykowego w synapsie wstęgowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-10T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Poznaj technikę patch-clamp całokomórkowego do rejestracji aktywności postsynaptycznej w synapsach wstęgowych wewnętrznych komórek rzęsatych ślimaka szczura. Ta metoda umożliwia badanie przetwarzania sygnałów słuchowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca została sfinansowana z grantu badawczego Deafness Research Foundation dla EY, grantu NIDCD DC006476 dla EG oraz grantu NIDCD DC005211 dla Center for Hearing and Balance w Johns Hopkins University. Prawa autorskie do ilustracji należą do Tim Phelps, Johns Hopkins University.
LG napisał wstępną wersję manuskryptu; EY i LG sfilmowali sekcję oraz nagranie. Wszyscy autorzy dostarczyli przykładowe ryciny i przyczynili się do napisania manuskryptu.

<ol><li>Glowatzki, E., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmitter+release+at+the+hair+cell+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transmitter release at the hair cell ribbon synapse.</a> Nat Neurosci. 5 (2), 147-154 (2002).</li>
<li>Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+calcium+dependence+of+transmitter+release+at+a+single+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Time course and calcium dependence of transmitter release at a single ribbon synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 16341-16346 (2007).</li>
<li>Yi, E., Roux, I., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+HCN+channels+shape+excitatory+postsynaptic+potentials+at+the+inner+hair+cell+afferent+synapse+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic HCN channels shape excitatory postsynaptic potentials at the inner hair cell afferent synapse in the mammalian cochlea.</a> J Neurophysiol. 103 (5), 2532-2543 (2010).</li>
<li>Grant, L., Yi, E., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+release+shape+the+postsynaptic+response+at+the+inner+hair+cell+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two modes of release shape the postsynaptic response at the inner hair cell ribbon synapse.</a> J Neurosci. 30 (12), 4210-4220 (2010).</li>
<li>LoGiudice, L., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ribbons+at+sensory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">The role of ribbons at sensory synapses.</a> Neuroscientist. 15 (4), 380-391 (2009).</li>
<li>Singer, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+multivesicular+release+at+a+mammalian+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse.</a> Nat Neurosci. 7 (8), 826-833 (2004).</li>
<li>Keen, E. C., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+characteristics+of+the+hair+cell%27s+afferent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5537-5542 (2006).</li>
<li>Li, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell%27s+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse.</a> J Neurosci. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li>
<li>Singer, J. H., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+depletion+and+synaptic+depression+at+a+mammalian+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Vesicle depletion and synaptic depression at a mammalian ribbon synapse.</a> J Neurophysiol. 95 (5), 3191-3198 (2006).</li>
<li>Suryanarayanan, A., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+mediated+by+internal+calcium+stores+in+rod+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission mediated by internal calcium stores in rod photoreceptors.</a> J Neurosci. 26 (6), 1759-1766 (2006).</li>
<li>Neef, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanism+of+exocytosis+at+the+hair+cell+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanism of exocytosis at the hair cell ribbon synapse.</a> J Neurosci. 27 (47), 12933-12944 (2007).</li>
<li>Tritsch, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+spontaneous+activity+in+the+developing+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origin of spontaneous activity in the developing auditory system.</a> Nature. 450 (7166), 50-55 (2007).</li>
<li>Kros, C. J., Ruppersberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+potassium+current+in+inner+hair+cells+during+development+of+hearing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expression of a potassium current in inner hair cells during development of hearing in mice.</a> Nature. 394 (6690), 281-284 (1998).</li>
<li>Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+of+frequency+representation+in+the+rat+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Developmental changes of frequency representation in the rat cochlea.</a> Hear Res. 56 (1-2), 1-7 (1991).</li>
<li>Seal, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Kluczowym etapem tej procedury jest sekcja. Jeśli tkanka zostanie rozciągnięta lub uszkodzona podczas sekcji, włókna dośrodkowe nie przetrwają. Tkanka młodszych szczurów jest bardziej elastyczna i mniej podatna na uszkodzenia. Uważamy, że dni postnatalne od 10 do 11 są najłatwiejsze do sekcji, a eksperymenty wykazują wówczas wyższy odsetek sukcesów. Znaczny stopień dojrzewania ślimaka zachodzi po narodzinach, a szczury zaczynają słyszeć około 12 dnia postnatalnego 14. W związku z tym w wieku, w którym sekcja jest najłatwiejsza, synapsy mogą nie być w pełni dojrzałe 4.

Opisana tutaj sekcja szczurów jest w zasadzie taka sama w przypadku myszy, przy czym główną różnicą jest mniejszy rozmiar ślimaka u myszy. Technika ta pozwala na badanie właściwości synaps wstęgowych u myszy modyfikowanych transgenicznie 15. Dalsze modyfikacje tej techniki obejmują: dodanie barwnika fluorescencyjnego do roztworu wewnątrzkomórkowego w celu znakowania włókien 3; rejestracje sparowane z presynaptyczną komórką włoskową wewnętrzną i postsynaptycznym kolbą aferentną, co pozwala na wyznaczenie funkcji przenoszenia między komórkami pre- i postsynaptycznymi 2, oraz pozakomórkowe rejestracje z luźnym uszczelnieniem (loose-seal) na kolbach aferentnych, aby uniknąć utraty integralności komórkowej. Konfiguracja rejestracji pozakomórkowej jest łatwiejsza do uzyskania niż konfiguracja whole-cell, a eksperymenty są zazwyczaj dłużej trwałe.

<table><tbody><tr><td>Stół pneumatyczny</td><td>TMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stół Gibraltar z przesuwem xy</td><td>Burleigh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy Axioscope FS2 z optyką DIC i filtrem zielonym</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera Newvicon z kontrolerem</td><td>Dage</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monitor</td><td>Dage</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B (lub podobny)</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1322A (lub podobny)</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulator MP285</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-kanałowy system zaworowy do aplikacji lokalnej perfuzji (stosowany z własnoręcznie wykonanymi pipetami perfuzyjnymi)</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC z oprogramowaniem do akwizycji danych (PClamp)</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Powyżej przedstawiono wyposażenie naszych układów elektrofizjologicznych wykorzystywanych do rejestracji z terminali aferentnych.</td></tr></tbody></table>

rejestracje postsynaptyczne w dendrytach aferentnych kontaktujących się z wewnętrznymi komórkami rzęskowymi ślimaka: monitorowanie uwalniania wielopęcherzykowego w synapsie wstążkowej

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

Synapsa aferentna między wewnętrzną komórką rzęskową (IHC) a włóknem nerwu słuchowego stanowi miejsce dostępne elektrofizjologicznie do rejestracji aktywności postsynaptycznej pojedynczej synapsy wstążkowej 1-4. Synapsy wstążkowe komórek sensorycznych uwalniają neurotransmiter w sposób ciągły, a szybkość tego procesu jest modulowana w odpowiedzi na stopniowe zmiany potencjału błony IHC 5. Wykazano, że synapsy wstążkowe funkcjonują poprzez uwalnianie wielopęcherzykowe, w którym wiele pęcherzyków może zostać uwolnionych jednocześnie, wywołując pobudzające prądy postsynaptyczne (EPSCs) o różnych amplitudach 1, 4, 6-11. Ani rola presynaptycznej wstążki, ani mechanizm leżący u podstaw uwalniania wielopęcherzykowego nie są obecnie dobrze poznane.
Komórki wewnętrzne (IHC) są unerwione przez 10–20 włókien nerwu słuchowego, przy czym każde włókno kontaktuje się z IHC za pomocą jednego niezmielinizowanego zakończenia, tworząc pojedynczą synapsę wstążkową. Mały rozmiar guzków aferentnych kontaktujących się z IHC (około 1 μm średnicy) umożliwia wykonywanie pomiarów z wyjątkową rozdzielczością czasową. Ponadto technikę tę można dostosować do jednoczesnej rejestracji z komórek przed- i postsynaptycznych, co pozwala na bezpośrednie badanie funkcji przenoszenia w synapsie 2. Metoda ta stanowi zatem narzędzie do badania podstawowych aspektów neurotransmisji, od uwalniania wielopęcherzykowego po nieuchwytną funkcję wstążki w komórkach sensorycznych.

Rejestracje metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell z dendrytów włókien nerwu słuchowego w obrębie synaps wstążkowych komórek rzęskowych wewnętrznych w ślimaku ssaków.

Rejestracje postsynaptyczne w dendrytach aferentnych kontaktujących się z wewnętrznymi komórkami rzęskowymi ślimaka: monitorowanie uwalniania wielopęcherzykowego w synapsie wstążkowej

Synapsa doprowadzająca pomiędzy wewnętrzną komórką słuchową (IHC) a włóknem nerwu słuchowego stanowi miejsce dostępne elektrofizjologicznie do rejestracji...

Ogólnym celem tej procedury jest rejestracja aktywności postsynaptycznej w synapsach aferentnych komórek rzęsnych wewnętrznych. Osiąga się to poprzez uprzednie odsłonięcie nabłonka sensorycznego ślimaka niedawno usuniętego od zdekapitowanego szczura. Drugim krokiem procedury jest umieszczenie wyciętego wierzchołka na zmodyfikowanym szkiełku nakrywce i przeniesienie go do komory rejestracyjnej.Trzecim krokiem procedury jest zlokalizowanie i uzyskanie dostępu do włókna doprowadzającego za pomocą elektrody rejestrującej. Ostatnim etapem procedury jest utworzenie szczelnego połączenia (seal) z membraną włókna doprowadzającego, a następnie jej przerwanie w celu ustanowienia konfiguracji whole cell techniki patch clamp. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące zdarzenia lub potencjały postsynaptyczne z pojedynczej synapsy wstążkowej za pomocą elektrofizjologii w konfiguracji whole cell patch clamp.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ dyssekcja i przygotowanie tkanki ślimaka są trudne do opanowania, a małe włókna doprowadzające są ciężkie do rozpoznania i uzyskania do nich dostępu. Przed rozpoczęciem dyssekcji przygotuj zmodyfikowane szkiełko nakrywkowe, które będzie utrzymywać preparat na miejscu podczas rejestracji. Używając okrągłego szkiełka nakrywkowego o średnicy od 8 do 12 mm, nanieś kroplę częściowo utwardzonego Sylgardu w pobliżu krawędzi szkiełka.Umieść grubszy koniec cienkiej szpilki entomologicznej na szkiełku nakrywkowym. Mocno przyciśnij szpilkę do szkła. Za pomocą pęsety podgrzej osłonę progu przeciwko rozgrzanej cewce, aby ją utrwalić.Przygotować od 10 do 20 mikroelektrod zgodnie z opisem w tekście towarzyszącym. Po wypalaniu mikrokuźnią średnica zewnętrzna czubka mikroelektrody powinna wynosić około 1 µm. Końcowa grubość ścianki pipety wynosi około 1/3 µm po znieczuleniu i dekapitacji trzytygodniowego szczura.Rozpocząć sekcję od usunięcia skóry, przeprowadzenia sekcji głowy i usunięcia mózgu. Aby odsłonić kość skroniową, należy usunąć obie kości skroniowe. Umieścić każdą kość skroniową w czystym naczyniu sekcyjnym zawierającym standardowy roztwór pozakomórkowy. Kolejnym krokiem jest usunięcie fragmentu kości otaczającego kość skroniową, aby odsłonić ślimaka.Mocno przytrzymaj kość skroniową u podstawy za pomocą pęsety. Zidentyfikuj okno okrągłe, okno owalne oraz ślimaka. Ustaw ślimaka tak, aby okno owalne i strona spiralna ślimaka były skierowane do góry.Usuń nadmiar kości wokół ślimaka. Używając drugiej pary precyzyjnych pęset, odłup fragmenty kości bezpośrednio ze ślimaka, zaczynając od obszaru, który jest bardziej przezroczysty niż pozostała część kości. W tym miejscu kość jest cieńsza i łatwiejsza do usunięcia.Kontynuuj usuwanie kości z okolic cewki szczytowej. Użyj mikroszczypców do rozcięcia modiolusa pod zakrętem szczytowym. Następnie oddziel zakręt szczytowy od niższych zakrętów ślimaka.Należy zadbać o ochronę cewki wierzchołkowej. Nie wolno jej ciągnąć ani rozciągać. Na koniec należy usunąć zwoje wierzchołkowe z małżatrętki, unikając nadmiernego rozdarcia tkanki.Użyj precyzyjnej pęsety, aby usunąć pozostałą część kości. Kolejnym krokiem jest usunięcie STR oculis oraz błony tialnej. Ostrożnie usuń STR oculis, czyli błyszczący pas tkanki znajdujący się na zewnątrz obszaru komórek rzęskowych.Należy uważać, aby nie usunąć komórek rzęsek sensorycznych, które mogą łatwo oddzielić się wraz z STR oculis. Następnie, za pomocą precyzyjnej pęsety, oddziel błonę tialną. Jest to błyszcząca, półprzezroczysta błona znajdująca się nad komórkami rzęsek sensorycznych; teraz należy odciąć nadmiar tkanki i kości oraz rozpłaszczyć preparat pęsetą.Jest to konieczne, aby tkankę można było równomiernie umieścić pod szpilką. Disekcja jest teraz zakończona. Umieść preparat pod szpilką na przygotowanym szkiełku nakrywkowym, dbając o to, aby po zakończeniu disekcji szpilka znajdowała się z dala od komórek rzęsek.Użyj pęsety, aby przenieść preparat do komory rejestracyjnej, utrzymując kroplę płynu zewnątrzkomórkowego na szkiełku nakrywkowym, na którym znajduje się tkanka ślimaka, a następnie niezwłocznie rozpocznij perfuzję roztworem zewnątrzkomórkowym. Aby zapewnić lepsze przeżycie preparatu, użyj obiektywu mikroskopu 10 x lub obiektywu DIC z imersją wodną 40 x. W celu zlokalizowania preparatu, ustaw go tak, aby elektrody rejestrujące mogły zbliżyć się do komórek rzęsnych wewnętrznych pod kątem prostym do ich ścian bocznych.Jeśli widoczność regionu podstawnego wewnętrznych komórek rzęsatych jest ograniczona z powodu zwinięcia się preparatu, należy użyć elektrody rejestrującej, aby docisnąć zewnętrzną krawędź preparatu do szkiełka nakrywki, uważając, by nie uciskać samych wewnętrznych komórek rzęsatych. W tym preparacie górna elektroda przytrzymuje zewnętrzną krawędź preparatu, a dolna elektroda zaznacza miejsce położenia batonów doprowadzających.Jako punkt odniesienia, kamera NC 70 Nuv Con wyświetla na monitorze powiększony obraz Forex, aby ocenić, czy tkanka w obszarze wewnętrznych komórek rzęsatych jest zdrowa. Zlokalizuj wiązki rzęsek jako punkt odniesienia, a następnie ustaw ostrość w dół, aby znaleźć jądra komórkowe. Przesuń ostrość dalej w dół, w stronę podstawy wewnętrznych komórek rzęsatych wraz z ich zakończeniami doprowadzającymi, a następnie wróć w górę, aż do osiągnięcia poziomu jąder komórkowych na monitorze.Teraz zlokalizuj batony doprowadzające wokół podstawy komórek rzęsistych wewnętrznych. Batony mają kształt sferyczny lub elipsoidalny, ich średnica wynosi około one micron i są jasne z błyszczącym wyglądem. Znajdziesz je, regulując ostrość w górę i w dół.Kolejnym krokiem jest udrożnienie dostępu do włókien doprowadzających przy użyciu elektrody rejestrującej z końcówką o średnicy 1 µm wypełnioną roztworem wewnątrzkomórkowym. Przyłóż dodatnie ciśnienie i za pomocą mikromanipulatora wprowadź elektrodę do preparatu. Użyj tej elektrody, aby wykonać nacięcie w preparacie na poziomie podstawy wewnętrznej komórki rzęsistej.Wsuń elektrodę pomiędzy cienką warstwę komórek podporowych a wewnętrzne komórki słuchowe, wykorzystując nadciśnienie, aby utworzyć drogę dostępu do obszaru u podstawy wewnętrznych komórek słuchowych. Ostrożnie wyjmij elektrodę i zastąp ją nową elektrodą o średnicy końcówki jednej mikrona, wypełnioną roztworem wewnątrzkomórkowym. Wykorzystując nadciśnienie w celu utrzymania czystości końcówki elektrody, przesuń elektrodę rejestrującą przez otwór dostępu, omijając sąsiednie komórki podporowe, w kierunku batonu aferentnego.Upewnij się, że końcówka elektrody znajduje się bezpośrednio przed włóknem doprowadzającym; włókna stawiają większy opór podczas ruchu pipety niż komórki podporowe i błona wewnętrznych komórek słuchowych. Różnicę tę można wyczuć podczas przesuwania pipety; przesuwaj pipetę w górę i w dół oraz naciskaj, aby upewnić się, że włókno się porusza. Świadczy to o tym, że końcówka pipety i włókno znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania, a elektroda jest dociśnięta do włókna doprowadzającego. Jednocześnie zwolnij nadciśnienie i zastosuj podciśnienie, aby utworzyć uszczelnienie gigaomowe.Zastosuj delikatne impulsy ssania, aby przerwać membranę wewnątrz elektrody i uzyskać rejestrację w konfiguracji whole-cell. Jeśli zapatchowana komórka jest aferentnym batonem, w trybie rejestracji whole-cell obserwuje się niewielkie przejściowe prądy pojemnościowe. Na tej rycinie przedstawiono typowy prąd przejściowy zarejestrowany z włókna aferentnego.Rozpocznij rejestrację aktywności synaptycznej. Jeśli włókno doprowadzające nie wykazuje aktywności spontanicznej, zdepolaryzuj komórkę rzęskową, stosując roztwór zewnątrzkomórkowy o wyższym stężeniu potasu. Na tym rysunku przedstawiono typowe zależności prądowo-napięciowe dla włókien AFF po lewej stronie oraz dla wewnętrznych komórek rzęskowych po prawej stronie.Zależności prądowo-napięciowe zarejestrowano przy potencjale trzymania wynoszącym -84 mV, stosując skoki napięcia od -124 mV do +36 mV w przyrostach co 10 mV. Napięcia są przedstawione po prawej stronie niektórych przebiegów, koncentrując się na zależnościach prądowo-napięciowych z włókna aferentnego. Zauważalna jest obecność pobudzeniowych prądów postsynaptycznych lub EPCs podczas większości skoków napięcia.EPC przeszły przez zero przy wartości około +6 mV. Rejestrację przeprowadzono w obecności tetrodotoksyny w celu zablokowania prądów sodowych zależnych od napięcia. Bez blokera w rejestracji pojawiłyby się dodatkowo szybko aktywowane wewnątrzkomórkowe prądy sodowe, co pozwoliłoby zidentyfikować zapis jako rejestrację z włókna doprowadzającego. Należy zwrócić uwagę na wolno aktywowany prąd wewnątrzkomórkowy przy napięciach hiperpolaryzacyjnych.Prąd ten nie występuje w wewnętrznych komórkach rzęsnych ani w komórkach podporowych, co stanowi dobrą wskazówkę, że rejestracja pochodzi z włókna doprowadzającego. Te zapisy przedstawiają zależności prądowo-napięciowe dla wewnętrznej komórki rzęsnej. Strzałka wskazuje szybko aktywowane zewnętrzne prądy potasowe przy potencjałach dodatnich.Następnie występują opóźnione prądy potasowe prostownicze, wynikające z małej średnicy pipety i wysokiej rezystancji dostępu. Przedstawione tutaj prądy komórek rzęsek wewnętrznych są mniejsze niż wymagane do uzyskania dokładnych zapisów prądów komórek rzęsek wewnętrznych. Należy stosować pipety o niższej rezystancji dostępu.Przedstawione tutaj rejestracje wykazują jednak, że relacje prądowo-napięciowe komórek włosych wewnętrznych i włókien doprowadzających można wyraźnie rozróżnić. Na tej rysunku przedstawiono prądy synaptyczne zarejestrowane z włókna doprowadzającego. Należy zwrócić uwagę na zmienną wielkość i kształt EPC.Rejestracje przeprowadzono w temperaturze pokojowej, stosując tetrodotoksynę w celu zablokowania napięciowo zależnych prądów sodowych. Na rysunku przedstawiono jednoczesne rejestracje z komórki włókienek wewnętrznych oraz kontaktującego się z nią batonu aferentnego. W celu depolaryzacji komórki włókienek wewnętrznych zastosowano skok napięcia, w odpowiedzi na który zarejestrowano w niej prądy wapniowe do wewnątrz; napływ jonów wapnia do komórki włókienek wewnętrznych skutkuje uwalnianiem neuroprzekaźnika i aktywacją EPC w batonie aferentnym.Należy zwrócić uwagę na depresję synaptyczną występującą podczas 50 milisekundowej depolaryzacji komórek rzęsnych wewnętrznych. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zachować ostrożność podczas wycinania i przygotowywania tkanki ślimaka oraz wykazać się cierpliwością i optymizmem podczas prób rejestracji z zakończeń aferentnych.

postsynaptic-recordings-at-afferent-dendrites-contacting-cochlear

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Nagrania postsynaptyczne na dendrytach afferencyjnych stykających się z koklewowymi komórkami włosowymi wewnętrznymi: Monitorowanie wielopęcherzykowego uwalniania w synapsie wstęgowej

W niniejszej pracy opisujemy protokół przygotowania skrawków siatkówki zatopionych w agarze, które nadają się do elektrofizjologii oraz obrazowania Ca2+. Metoda ta pozwala na badanie synaps wstążkowych w mikroobwodach siatkówki przy użyciu bezpośrednich rejestracji patch-clamp z pojedynczych przedsynaptycznych zakończeń nerwowych.

Pomiary pojemności metodą patch-clamp oraz obrazowanie Ca2+ w pojedynczych zakończeniach nerwowych w skrawkach siatkówki

Ten film demonstruje połączone nagrywanie mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w mieszkach włosowych małżowiny usznej myszy. Przedstawiono w nim etapy mechanicznej stymulacji zakończeń nerwowych mieszków włosowych przed i po ekspozycji na barwnik z membrany fluorescencyjnej, elektrofizjologię rejestrującą generowane potencjały czynnościowe oraz wizualizację znakowania zakończeń nerwowych w mieszkach włosowych.

Połączony zapis mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w mieszkach włosowych myszy

Ten film demonstruje metodę oceny synaps wstęgowych w określonych regionach ślimaka myszy. Wykorzystuje techniki barwienia immunologicznego i obrazowania konfokalnego w celu identyfikacji funkcjonalnych synaps w różnych regionach częstotliwości w każdym skręcie ślimaka.

Ocena synaps wstęgowych w określonych obszarach częstotliwości ślimaka myszy

Przedstawiono prostą i nowatorską technikę rejestrowania wyładowań doprowadzających z powodu mechanicznej stymulacji lancetowatych końcówek końcówek palisadowych, unerwiających mysie, skóry uszu, mieszków włosowych.

Połączony zapis mechanicznie stymulowanego wydzielania aferentnego i znakowania zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych myszy

Prądy synaptyczne mogą być rejestrowane ogniskowo z wizualizowanych bulionów synaptycznych w trzecim stadium rozwojowym połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila. Technika ta umożliwia monitorowanie aktywności pojedynczego bulionu synaptycznego.

Ogniskowe zapisy makroplastów prądów synaptycznych z połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Ten protokół opisuje metody rejestrowania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u pourodzonych szczurzych szczeniąt. Aby zbadać rozwój funkcjonalny zewnętrznych komórek rzęsatych, opisano krok po kroku eksperymentalną procedurę rejestracji klamry krosowej całej komórki w izolowanych zewnętrznych komórkach rzęsatych.

Rejestracja słuchowej odpowiedzi pnia mózgu i zewnętrznego zacisku krosowego całych komórek rzęsatych u szczurów po urodzeniu

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji wychwytu 3 kDa Texas Red-labeled dextranu w słuchowych komórkach rzęsatych z funkcjonalnymi kanałami mechanotransdukcji. Ponadto dektrans o stężeniu 3–10 kDa może być stosowany do badania endocytozy we włosach i komórkach podporowych narządu Cortiego.

Znakowanie i wychwyt dekstranu w żywych i funkcjonalnych mysich komórkach rzęsatych ślimaka

Przedstawiono protokół przetwarzania ślimaków młodych dorosłych i starszych myszoskoczków poprzez immunoznakowanie aferentnych struktur synaptycznych i komórek rzęsatych, wygaszanie autofluorescencji w starzejącej się tkance, preparowanie i szacowanie długości ślimaka oraz ilościowe określanie synaps w stosach obrazów uzyskanych za pomocą obrazowania konfokalnego.

Znakowanie immunologiczne i zliczanie synaps wstęgowych u ślimaków młodych dorosłych i starszych myszoskoczków

Przedstawione tutaj są metody dostarczające szczegółowych instrukcji do preparowania, dysocjacji, hodowli i rejestracji patch-clamp z neuronów zwojów przedsionkowych i spiralnych ucha wewnętrznego.

Izolowanie i hodowla somaty przedsionkowej i spiralnej zwoju zwojowego od noworodków gryzoni w celu nagrań typu patch-clamp

Poznaj technikę patch-clamp całokomórkowego do rejestracji aktywności postsynaptycznej w synapsach wstęgowych wewnętrznych komórek rzęsatych ślimaka szczura. Ta metoda umożliwia badanie przetwarzania sygnałów słuchowych.

Zapisy postsynaptyczne w dendrytach aferentnych kontaktujących się z wewnętrznymi komórkami rzęsatymi ślimaka: monitorowanie uwalniania wielopęcherzykowego w synapsie wstęgowej (Wideo) | JoVE Journal

Rejestracje postsynaptyczne w dendrytach aferentnych kontaktujących się z wewnętrznymi komórkami rzęskowymi ślimaka: monitorowanie uwalniania wielopęcherzykowego w synapsie wstążkowej

Przeglądaj więcej filmów