Zapisy postsynaptyczne w dendrytach aferentnych kontaktujących się z wewnętrznymi komórkami rzęsatymi ślimaka: monitorowanie uwalniania wielopęcherzykowego w synapsie wstęgowej

Ogólnym celem tej procedury jest rejestracja aktywności postsynaptycznej w wewnętrznych synapsach aferentnych komórek rzęsatych. Osiąga się to poprzez najpierw odsłonięcie nabłonka czuciowego ślimaka niedawno usuniętego ze szczura, któremu odcięto głowę. Drugim etapem procedury jest ustawienie wyciętego wierzchołka, włączenie zmodyfikowanego szkiełka nakrywkowego i przeniesienie go do komory rejestracyjnej.

Trzecim krokiem procedury jest zlokalizowanie i uzyskanie dostępu do pałki aferentnej z elektrodą rejestrującą. Ostatnim etapem procedury jest szczelne uszczelnienie, a następnie pęknięcie membrany z włókien doprowadzających, ustalając całą konfigurację komórek w technice zaciskania krosowego. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują występowanie lub potencjały postsynaptyczne od pojedynczej synapsy wstęgowej do elektrofizjologii klamrów łatek całych komórek.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ sekcja i przygotowanie tkanki ślimaka jest trudne do nauczenia, a małe włókna doprowadzające są trudne do rozpoznania i dostępu. Przed przystąpieniem do sekcji należy przygotować zmodyfikowane szkiełko nakrywkowe, które utrzyma preparat na miejscu podczas nagrań. Używając okrągłego szklanego szkiełka nakrywkowego o grubości od 8 do 12 milimetrów, nałóż kroplę na wpół utwardzonej osłony syl w kierunku krawędzi szkiełka nakrywkowego.

Umieść gruby koniec cienkiej szpilki przeciw owadom na szkiełku nakrywkowym. Przyciśnij mocno szpilkę do szkła. Za pomocą kleszczy podgrzej osłonę parapetu przed rozgrzaną cewką, aby zastygła.

Przygotuj od 10 do 20 mikroelektrod zgodnie z opisem w załączonym tekście. Po polerowaniu ogniowym za pomocą mikro kuźni, mikroelektroda powinna mieć zewnętrzną średnicę końcówki około jednego mikrona. Ostateczna grubość ścianki pipety wynosi około jednej trzeciej mikrometra po znieczuleniu i dekapitacji trzytygodniowego szczura.

Rozpocznij sekcję od usunięcia skóry bi preparując głowę i usuwając mózg Aby odsłonić kość skroniową, usuń obie kości skroniowe. Umieść każdą kość skroniową w czystym naczyniu preparacyjnym zawierającym standardowy roztwór zewnątrzkomórkowy. Kolejnym krokiem jest usunięcie kości, otaczając kość skroniową, tak aby odsłonić ślimak.

Trzymaj kość skroniową bezpiecznie u podstawy za pomocą kleszczy. Zidentyfikuj okrągłe i owalne okienko oraz ślimak. Ustaw ślimak tak, aby owalne okienko i spiralna strona ślimaka były skierowane do góry.

Usuń nadmiar kości wokół ślimaka. Użyj drugiej pary cienkich kleszczy, aby odłupać kość bezpośrednio ze ślimaka, zaczynając od obszaru, który jest bardziej przezroczysty niż reszta kości. Tutaj kość jest cieńsza i łatwiejsza do usunięcia.

Kontynuuj usuwanie kości z okolic cewki wierzchołkowej. Użyj mikronożyczek preparacyjnych, aby przeciąć modis pod zwojem wierzchołkowym. Następnie odłącz zwój wierzchołkowy od dolnych zwojów ślimaka.

Zadbaj o ochronę cewki wierzchołkowej. Nie należy go ciągnąć ani rozciągać. Na koniec usuń zwój wierzchołkowy ze ślimaka, nie rozrywając zbytnio tkanki.

Użyj cienkich kleszczy, aby usunąć resztę kości. Następnym krokiem jest usunięcie STR oka i błony kostnej. Ostrożnie usuń STR oka, błyszczący pasek tkanki znajdujący się poza obszarem komórek włosa.

Upewnij się, że nie usuwasz czuciowych komórek rzęsatych, które mogą łatwo odczepić się wraz z STR oka. Następnie użyj cienkich kleszczyków, aby odłączyć błonę zębową. Błyszcząca, półprzezroczysta membrana, która znajduje się nad czuciowymi komórkami rzęsatymi, przycina teraz nadmiar tkanki i kości oraz spłaszcza preparat za pomocą kleszczy.

Jest to konieczne, aby tkankę można było równomiernie umieścić pod szpilką. Sekcja została zakończona. Umieścić preparat pod szpilką na przygotowanym szkiełku nakrywkowym, zwracając uwagę, aby po zakończeniu preparacji umieścić szpilkę z dala od komórek rzęsatych.

Za pomocą kleszczy przenieś preparat do komory rejestrującej, trzymając kroplę płynu zewnątrzkomórkowego na szkiełku nakrywkowym, które utrzymuje tkankę ślimaka, natychmiast rozpocznij obfitowanie roztworem zewnątrzkomórkowym. Aby zapewnić lepszą przeżywalność preparatu, należy użyć obiektywu mikroskopu 10 x lub obiektywu DIC 40 x zanurzenia w wodzie. Aby zlokalizować preparat, należy ustawić preparat w taki sposób, aby elektrody rejestrujące mogły zbliżyć się do wewnętrznych komórek rzęsatych pod kątem prostym do ich bocznych ścianek.

Jeżeli widoczność obszaru podstawnego wewnętrznych komórek rzęsatych jest ograniczona z powodu zwinięcia preparatu, należy użyć elektrody rejestrującej, aby docisnąć zewnętrzną krawędź preparatu do szklanego szkiełka nakrywkowego. Uważaj, aby nie naciskać na same wewnętrzne komórki rzęsate. W tym preparacie górna elektroda przytrzymuje zewnętrzną krawędź preparatu w dół dolnych znaczników elektrody, w których znajdują się pałki doprowadzające.

Dla porównania, kamera NC 70 Nuv Con wyświetla na monitorze powiększony obraz Forex, aby ocenić, czy tkanka w wewnętrznym obszarze komórek rzęsatych jest zdrowa. Znajdź wiązki włosów jako punkt odniesienia i skup się w dół, aby znaleźć jądra. Skup się dalej w dół w kierunku podstawy wewnętrznych komórek rzęsatych z ich aferentnymi końcami i z powrotem w górę, aż osiągniesz poziom jąder na monitorze.

Teraz zlokalizuj aferentne pałki wokół podstawy wewnętrznych komórek rzęsatych. Pałki są kuliste lub elipsoidalne, o średnicy około jednego mikrona i mają jasny kolor i błyszczący wygląd. Znajdziesz je, skupiając się w górę iw dół.

Następnym krokiem jest udrożnienie drogi do włókien aferentnych za pomocą elektrody rejestrującej z jednomikronową końcówką wypełnioną roztworem wewnątrzkomórkowym. Zastosuj nadciśnienie i za pomocą mikromanipulatora manewruj elektrodą do preparatu. Za pomocą tej elektrody należy wykonać nacięcie w preparacie na poziomie wewnętrznej podstawy komórki rzęsatej.

Wepchnij elektrodę między cienką warstwę komórek nośnych a wewnętrzne komórki rzęsate za pomocą nadciśnienia, aby wykuć drogę dostępu do obszaru u podstawy wewnętrznych komórek rzęsatych. Ostrożnie wyjmij elektrodę i zastąp ją świeżą elektrodą z końcówką o średnicy jednego mikrona wypełnioną roztworem wewnątrzkomórkowym. Używając nadciśnienia w celu utrzymania czystej końcówki elektrody, przesuń elektrodę rejestrującą przez otwór dostępowy wokół sąsiednich ogniw nośnych w kierunku pałki doprowadzającej.

Upewnij się, że końcówka elektrody znajduje się bezpośrednio przed doprowadzającymi pałkami pałeczkowymi, które stawiają większy opór ruchowi pipety niż komórki nośne i wewnętrzna błona komórek rzęsatych. Różnica ta może być wyczuwalna, gdy pipeta jest poruszana, przesuwaj pipetę w górę i w dół, a następnie naciskaj, aby upewnić się, że bhuton się porusza. Oznacza to, że końcówka pipety i bhuton znajdują się w tej samej płaszczyźnie ostrości, a elektroda jest dociśnięta do doprowadzającego bhutonu Jednocześnie uwolnij nadciśnienie i zastosuj ssanie, aby utworzyć uszczelnienie giga omów.

Zastosuj delikatne impulsy ssania, aby rozerwać membranę w elektrodzie, aby uzyskać zapis całej komórki. Jeśli załatana komórka jest pałką aferentną, w trybie zapisu całej komórki obserwuje się małe pojemnościowe stany przejściowe. Ten rysunek pokazuje typowy stan nieustalony zarejestrowany z włókna doprowadzającego.

Rozpocznij rejestrowanie aktywności synaptycznej. Jeśli włókno doprowadzające nie wykazuje spontanicznej aktywności, należy zdepolaryzować komórkę rzęsatą poprzez zastosowanie roztworu zewnątrzkomórkowego o wyższym stężeniu potasu. Rysunek ten przedstawia typowe relacje napięcia prądu dla włókien AFF po lewej stronie i wewnętrznych komórek rzęsatych po prawej.

Obecne zależności napięcia zarejestrowano z potencjałem podtrzymania minus 84 miliwoltów przy krokach napięcia od minus 124 miliwoltów do dodatnich 36 miliwoltów w krokach co 10 miliwoltów. Napięcia są pokazane po prawej stronie niektórych ścieżek skupiających się na aktualnych relacjach napięcia z włókna doprowadzającego. Należy zauważyć, że pobudzające występowanie postsynaptyczne lub EPC są obecne podczas większości kroków napięcia.

EPC odwróciły dodatni wynik na poziomie około dodatnich sześciu miliwoltów. To nagranie zostało przeprowadzone w obecności tetra do toksyny w celu zablokowania prądów sodowych bramkowanych napięciem bez blokera Szybko aktywujące prądy wewnętrzne sodu dodatkowo pojawiłyby się w nagraniu i zidentyfikowałyby nagranie jako zapis światłowodu aferentnego. Uwaga, powoli aktywujący się prąd wewnętrzny przy napięciach hiperpolaryzacyjnych.

Prąd ten nie występuje w wewnętrznych komórkach rzęsatych ani komórkach nośnych i stanowi dobrą wskazówkę, że zapis pochodzi z włókna doprowadzającego. Nagrania te pokazują aktualne relacje napięcia dla wewnętrznej komórki rzęsanej. Strzałka wskazuje na szybko aktywujące się na zewnątrz prądy potasowe o dodatnim potencjałie.

Po nich następują opóźnione prądy potasowe prostownika ze względu na małą średnicę pipety i wysoką rezystancję dostępu. Pokazane tutaj wewnętrzne prądy komórek rzęsatych są mniejsze niż oczekiwano, aby uzyskać dokładne zapisy wewnętrznych prądów komórek rzęsatych. Należy używać pipet o mniejszych rezystancjach dostępu.

Prezentowane tu nagrania pokazują jednak, że można wyraźnie rozróżnić aktualne relacje napięciowe wewnętrznych komórek rzęsatych i włókien doprowadzających. Ten rysunek pokazuje prądy synaptyczne zarejestrowane z włókna doprowadzającego. Zwróć uwagę na zmienny rozmiar i kształt świadectw charakterystyki energetycznej.

Nagrania zostały wykonane w temperaturze pokojowej z tetra toiną zastosowaną w celu zablokowania prądów sodowych bramkowanych napięciem. Rysunek ten pokazuje równoczesne nagrania z wewnętrznej komórki włosowej i kontaktującej się pałki doprowadzającej. Do depolaryzacji wewnętrznej komórki rzęsatej zastosowano krok napięciowy, a w odpowiedzi zarejestrowano wewnętrzne prądy wapnia z wewnętrznej komórki rzęsatej napływ wapnia, co spowodowało uwolnienie neuroprzekaźników i aktywację EPC w pałce doprowadzającej.

Zwróć uwagę, że depresja synaptyczna pojawiająca się podczas 50-milisekundowej depolaryzacji wewnętrznych komórek rzęsatych Podczas próby tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu ostrożności podczas preparowania i przygotowywania tkanki ślimaka oraz o zachowaniu cierpliwości i optymizmu podczas próby nagrywania z terminali doprowadzających.