JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:42 min. • February 26th, 2026
Weź hodowlę paciorkowca grupy B, czyli GBS, oportunistycznego patogena bakteryjnego.
Rozcieńcz hodowlę w świeżym podłożu i inkubuj, aby uzyskać aktywnie dzielące się bakterie.
Przenieś posiew do stożkowej rurki.
Wiruj w wirówce, aby rozpylić bakterie, a następnie wyrzuć supernatant.
Przemyj bakterie buforem.
Ponownie wiruję w wirówce, usuwam supernatant i ponownie zawiesisz bakterie w buforze.
Następnie użyj myszy poddany hormonom z nabłonkiem pochwy, bardziej podatną na infekcje.
Unieruchom mysz. Używając cienkiej końcówki pipety, wylej zawiesinę GBS do światła pochwy.
Puść mysz, podnieś jej ogon i pozwól przednim łapom chodzić po twardej powierzchni.
To sprzyja zatrzymaniu inokulum w świetle pochwy, umożliwiając przyleganie do GBS.
Sprawdź otwór pochwy pod kątem cofania się inokulum.
Przyklejone bakterie kolonizują powierzchnię nabłonka pochwy i wywołują infekcję.
Model myszy z infekcją pochwy jest gotowy do dalszych badań.
Tego samego dnia co zastrzyk hoduj pięciomililitrową, nocną płynną hodowlę szczepu GBS interesującego go w bulionie Todd Hewitt, czyli THB, w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnego ranka podhodować GBS w objętości 1 do 10 w świeżym THB przez dwie do trzy godziny inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż bakterie osiągną fazę środkową logariatu. Następnie przenieś podkulturę do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i odwirować komórki bakteryjne. Ponownie zawiesij pellet w 200 mikrolitrach sterylnego PBS.
Następnie zwiększ całkowitą objętość zawiesiny do 1 mililitra PBS na 10 myszy, aby osiągnąć OD600 0,4 w nowej, 5-mililitrowej tubce hodowlanej. Przełóż hodowlę do nowej probówki o pojemności 15 milimetrów i ponownie rozpyl bakterie. Następnie ponownie zawiesij komórki w PBS na jednej dziesiątej pierwotnej objętości.
Zarezerwuj 50 mikrolitrów bakterii do seryjnego rozcieńczania i powłokowania na agarze THB, aby określić dokładną liczbę CFU inokulum. Następnie należy pobrać 10 mikrolitrów GBS do końcówki pipety z żelem o pojemności 200 mikrolitrów i ręcznie zabezpieczyć luźną skórę na karku pierwszego zwierzęcia między kciukiem a palcem wskazującym, a następnie unieruchomić ogon. Włóż końcówkę pipety 5 do 10 milimetrów do światła pochwy i wydaj całą objętość inokulum.
Następnie natychmiast puść kark i podnieś ogon, aby unieść tylną część zwierzęcia, jednocześnie przesuwając przednie łapy po twardej powierzchni. Po minucie wizualnie sprawdź otwór pochwy pod kątem cofania się inokulum.