Ilościowe tłumienie biofilmu indukowanego enzymami u bakterii patogennych

Weź mikropłytkę zawierającą dołki kontrolne i lecznicze, z których każda jest zaszczepiona biofilmową, patogenną bakterią.

Studnie lecznicze zawierają enzym, który zakłóca tworzenie biofilmu.

Inkubować w warunkach mikrobeztlenowych, aby stworzyć środowisko o niskiej zadołce tlenu. Sprzyja to wydzielaniu bakteryjnych cząsteczek sygnałowych, które pośredniczą w przyczepności powierzchniowej. W dołkach leczniczych enzym rozkłada te cząsteczki, zmniejszając tym samym przyczepność bakterii.

Płucz studnie, aby usunąć nieprzylegające komórki.

Wprowadź świeże podłoże i inkubuj. Przyklejone bakterie mnożą się i wydzielają pozakomórkowe substancje polimerowe, które tworzą matrycę biofilmową.

Usuń podłoże i umyj studnie.

Dodaj barwnik kationowy i inkubuj, aby umożliwić wiązanie ujemnie naładowanych składników biofilmu.

Umyj, żeby usunąć niewiązany barwnik.

Inkubuj rozpuszczalnikiem poddawanym mieszaniu, aby uwolnić związany barwnik do roztworu.

Zmierz gęstość optyczną (OD), aby ilościowo określić biomasę biofilmu.

Niższy OD w dołkach leczonych odzwierciedla zmniejszone tworzenie biofilmu, wynikające z upośledzonej początkowej przyczepności komórek.

Na początek hoduj 5-mililitrową hodowlę A. baumannii S1 w LB w temperaturze 30 stopni Celsjusza w inkubatorze wstrząsającym przez 16 godzin.

Dostosuj kulturę do OD₆₀₀ 0,8. Następnie użyj świeżego LB zawierającego 4 miligramy na mililitr oczyszczonego enzymu GKL, aby rozcieńczyć hodowlę od 1 do 100. I dodaj 100 mikrolitrów do odwiertów płyty z 96 dołami.

Użyj pokrywek, aby przykryć talerze i umieść je w plastikowym pojemniku o pojemności 10 litrów. Zamknij pojemnik i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy godziny, zanim delikatnie wyjmij podłoże. Dodaj kolejne 100 mikrolitrów świeżego medium LB do studni i inkubuj płytę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 21 godzin.

Po delikatnym usunięciu podłoża użyj 200 mikrolitrów sterylnej wody, aby delikatnie przemyć komórki bakterii planktonowych. Umieść końcówkę pipety na dnie studni i ostrożnie usuń płynne medium, aby zapewnić minimalne zakłócenia na biofilmie między granicą powietrze a ciecz. Następnie do każdego dołku dodaj 100 mikrolitrów roztworu fioletu kryształowego o stężeniu i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Usuń roztwór fioletowy kryształów, używając 200 mikrolitrów sterylnej wody do trzykrotnego przemycia studni. Dodaj 100 mikrolitrów kwasu octowego 33% do każdego dołka i inkubuj przez delikatne potrząsanie przez 15 minut, aby rozpuścić barwnik. Ilościowo określ ilość biofilmu, mierząc absorpcję kryształowego fioletu na 600 nanometrach. Ilość kryształowego fioletu jest proporcjonalna do ilości powstałego biofilmu.