JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:47 min. • February 26th, 2026
Zacznij od dwóch mikromisek na szklanym dnie zawierających zawiesiny bakterii tworzącej biofilm.
Naczynie lecznicze zawiera aktywny enzym zakłócający sygnalizację, natomiast kontrola obejmuje enzym inaktywowany.
Przykryj naczynia i inkubuj, aby umożliwić przyleganie bakterii do powierzchni mikromiski.
Przemyj ją, aby usunąć nieprzylegające komórki, następnie wprowadź świeże medium zawierające enzymy i inkubuj.
W misce kontrolnej bakterie komunikują się za pomocą cząsteczek sygnalizujących i produkują pozakomórkowe substancje polimerowe (EPS), tworząc biofilm.
Aktywny enzym rozkłada cząsteczki sygnalizacyjne, zakłócając ich funkcjonowanie i ograniczając tworzenie biofilmu.
Uzupełnij świeżym medium i inkubuj dalej, aby wzmocnić działanie enzymu zakłócające biofilm.
Usuń podłoże, dodaj lektyny oznaczone fluorescencją i inkubuj, aby umożliwić wiązanie lektyn z EPS.
Myj, aby usunąć niewiązane lektyny.
Inkubuj za pomocą utrwalacza, aby zachować architekturę biofilmu, a następnie przepłucz naczynie.
Wykonaj obrazy mikroskopii konfokalnej w celu oceny enzymatycznego hamowania powstawania biofilmu.
Aby przeprowadzić konfokalną laserową mikroskopię skaningową, czyli CLSM, biofilmów A. baumannii S1, hodować hodowlę 5-mililitrową A. baumannii S1 w LB w temperaturze 30 stopni Celsjusza w inkubatorze potrząsającym przez 16 godzin. Dostosuj kulturę A. baumannii S1 do OD600 wynoszącej 0,8.
Następnie użyj świeżego LB zawierającego 1,2 miligrama na mililitr oczyszczonego enzymu GKL, aby rozcieńczyć hodowlę, od 1 do 100, i dodać 1 mililitr do mikromiseczki o pojemności 35 mililitrów o szklanym dnie. Przykryj mikromiskę pokrywką i umieść ją w plastikowym pojemniku o pojemności 10 litrów, a następnie zapieczętuj przed inkubacją naczynia w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po delikatnym usunięciu podłoża dodaj 1 mililitr świeżego medium zawierającego 30 mikrolitrów oczyszczonego enzymu GKL, a następnie inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez kolejne 21 godzin.
Delikatnie usuń podłoże po raz drugi i zamień go kolejnym 1 mililitrem enzymu GKL w świeżym medium. Inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji delikatnie usuń podłoże i dodaj 500 mikrolitrów 5 mikrogramów na mililitr Alexa Fluor 488 sprzężonej aglutininy zarodków pszenicy rozpuszczonej w HBSS.
Inkubuj mikromikę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby zabarwić biofilmy. Aby utrwalić biofilmy, dodaj 500 mikrolitrów 3,7% rozpuszczonego formaldehydu w HBSS i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Użyj 2 mililitrów HBSS do mycia mikromiski raz, a następnie całkowicie usuń roztwór.
Przechowuj naczynie w ciemności w temperaturze 4 stopni Celsjusza przed wykonaniem obrazowania CLSM. Do obrazowania i analizy CLSM użyj obiektywu 63 X, aby wygenerować 97 stosów na obraz z interwałem 0,21 mikrona na stos.