JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:06 min. • February 26th, 2026
Zacznij od hodowli Actinomyces zakażonej Saccharibacteria.
Sacharybakterie, ultramała bakteria pasożytnicza, wraz z żywicielem tworzą kulturę binarną.
Dodaj aliquot zainfekowanej kultury do rurki PCR zawierającej odczynniki wzmacniające z barwnikiem śledzącym elektroforezę oraz schorzeniami specyficznymi dla Saccharibacteria.
Umieść rurkę w termocyklerze z ustawionymi warunkami PCR.
Podczas początkowej denaturacji ciepło rozpuszcza Sacharibakterie, uwalniając genomowe DNA. Actinomyces pozostają nienaruszone dzięki sztywnym ścianom komórkowym, co ogranicza uwalnianie DNA gospodarza.
Ciepło następnie denaturuje nici DNA Saccharibacteria i aktywuje polimerazę Taq.
Podczas wyżarzania startery wiążą się z komplementarnymi sekwencjami w genomie Saccharibacteria.
W rozszerzeniu polimeraza Taq dodaje dNTP do starterów, syntetyzując nowe nici DNA.
Załaduj wzmocniony produkt PCR na żel agarozowy wstępnie barwiony barwnikiem, który wiąże się z fragmentami DNA.
Uruchom elektroforezę i zwizualizuj żel pod światłem UV.
Specyficzny dla Saccharibacteria pas amplikonu potwierdza interakcję gospodarza z pasożytem w kulturze binarnej.
Zrób 24 mikrolitry głównej mieszanki PCR do rurki PCR o pojemności 0,2 mililitra. Na jeden mikrolitr zakażonej sacharybakterią hodowlę i umieść probówkę w termocyklerze.
Ustaw program PCR zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Załaduj i uruchom produkty PCR na żelu Agros o stężeniu 1%. Pasmo około 600 zasad potwierdzi obecność sacharybakterii.