JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:15 min • March 31st, 2026
Zacznij od siewek kukurydzy rosnących w kontrolowanych warunkach, które będą służyć jako żywiciel.
Następnie weź Agrobacterium tumefaciens, bakterię patogenną dla roślin.
Bakterie inżynieryjne noszą konstrukcję T-DNA kodującą rekombinowany genom wirusa. Ten genom zawiera włożony fragment genu zaprojektowany do uciszenia docelowego genu kukurydzy.
Wstrzyknij bakterie tuż nad węzłem koleoptylarnym, najniższym w roślinie, aż zawiesina wypełni koleoptyl, zapewniając dostarczenie do tkanek wewnętrznych.
W miejscu iniekcji bakterie przenoszą T-DNA przenoszące genom wirusa do komórek kukurydzy, gdzie jest ono transkrybowane do wirusowego RNA, które przechodzi do cytoplazmy.
RNA replikuje się i wywołuje produkcję białek wirusowych, tworząc nowe cząstki wirusa, które rozprzestrzeniają się systemowo, prowadząc do zakażenia.
RNA wirusa niosące pożądany fragment genu aktywuje mechanizm interferencyjny RNA rośliny, degradując specyficzne mRNA kukurydzy i wyciszając gen docelowy.
Skutkuje to widocznymi zmianami fenotypów regulowanymi przez gen docelowy w miarę wzrostu zakażonych roślin, takimi jak powstawanie martwiczych zmian, potwierdzających skuteczne wyciszanie genów.
Do wstrzykiwania Agrobacterium używaj siewek kukurydzy mających 4 do 7 dni. Złóż strzykawkę i igłę. Delikatnie wstrzykuj zawiesinę bakteryjną 2-3 milimetry nad węzłem koleoptillularnym, aż wypełni koleoptyl lub stanie się widoczna w zakręcie, w zależności od stadium wzrostu roślin.
Wstrzyknij wszystkie siewki i wymień strzykawkę oraz igły do wstrzyknięcia każdego konstruktu. Potwierdź zakażenie fenotypowe, obserwując zmiany spowodowane wyciszaniem genów kontrolnych, mimika zmian 22 lub fitoenodesaturuzy na liściach.