Immunobarwienie mikrozmian wypełnionych bakteriami w przekroju tkanki sercowej myszy do obrazowania

Zacznij od preparatu zawierającego chemicznie utrwalony fragment tkanki sercowej myszy zakażonej bakterią Streptococcus pneumoniae, patogenną bakterią.

Ta infekcja powoduje powstawanie pozakomórkowych, wypełnionych bakteriami mikrozmian w mięśniach sercowych.

Przemyj ten fragment buforem, aby usunąć resztki utrwalających.

Stosuj niejonowy detergent, aby przepuścić błony komórkowe gospodarza.

Pierz ponownie, aby usunąć resztki detergentu.

Inkubuj przekroj środkiem blokującym, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania.

Przepłukaj, aby usunąć niezwiązany środek blokujący.

Wprowadź pierwotne przeciwciało wiążące się z kapsularnym polisacharydem bakterii.

Przemyj, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała, a następnie dodaj zielone przeciwciało wtórne oznaczone fluoroforem, które wiąże się z pierwotnym przeciwciałem.

Barwnik przeciwbarwnik jądrowy, aby oznaczyć jądra komórek gospodarza.

Umyj tę część i zamontuj ją za pomocą nośnika mocowania.

Obserwuj ten przekrój za pomocą mikroskopii konfokalnej, aby zobrazować oznakowane bakterie wewnątrz mikrozmian.

Używając 5-mikronowej sekcji serca na szkiełkach o dodatnio naładowanym szkiełku, najpierw zamroz te fragmenty, następnie rozmroź i pozwól wyschnąć na powietrzu. Utrwal szkiełka w 10% neutralnej buforowanej formalinie przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie usuń utrwalacz po trzech myciach i stosuj PBS przez pięć minut na każde pranie.

Następnie permeabilizuj tkankę 0,2% Triton X-100 w PBS przez 15 minut. Usuń detergent po trzech kolejnych praniach w czystym PBS. Następnie zablokuj tkankę 10% surowicą kozą w PBS na godzinę. Po płukaniu w PBS pokryj ten fragment surowicą przeciw surowicy na dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Leczcie negatywne środki przeciw naivnemu królikowi.

Ponieważ tkanka sercowa łatwo absorbuje barwnik immunofluorescencyjny XI, co prowadzi do wysokich poziomów tła, stężenie w czasie inkubacji dla różnych typów przeciwciał będzie prawdopodobnie wymagało optymalizacji.

Dwie godziny później zmyj surowicę PBS. Następnie zastąpić roztwór przeciwciałem wtórnym i pozwól szkiełkom inkubować się w 37 stopniach Celsjusza przez kolejne 30 minut. Teraz nałóż DAPI w dawce 5 miligramów na mililitr i umyj szkiełka PBS. Na koniec zamontuj preparaty w FluorSave i sfotografuj je mikroskopią konfokalną.