JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:32 min. • February 26th, 2026
Inkubuj komorowe szkło pokrywkowe zawierające przyklejone bakterie w podłożu uzupełnionym filtratem plwociny pochodzącym z mukowiscydozy oraz wyłącznie w podłożu.
Filtrat plwociny zawiera składniki pochodzące od gospodarza, które stymulują bakteryjne szlaki sygnalizacyjne, wywołując produkcję matrycy i tworzenie biofilmu.
Po utworzeniu biofilmów odrzuć medium zawierające wolno unoszące się bakterie oraz pozostałe składniki pochodzące od gospodarza.
Umyj z buforem, aby usunąć luźno przylegające bakterie.
Dodaj mieszankę barwiącą zawierającą fluorescencyjne barwniki przepuszczalne i nieprzepuszczalne przez błony i inkubuj w ciemności.
Błonowoprzepuszczalny barwnik przecina nienaruszone błony, oznaczając zarówno bakterie żyjące, jak i nieżywotne. Natomiast nieprzepuszczalny barwnik przenika tylko do uszkodzonych błon, selektywnie oznaczając bakterie niezdolne do życia.
Po inkubacji usuń roztwór barwiący i przepłucz buforem, aby wyeliminować nadmiar barwnika i zmniejszyć fluorescencję tła.
Dodaj świeże medium i wykonuj zdjęcia za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Biofilmy uprawiane z filtratem plwociny wykazują zwiększoną grubość, podkreślając rolę składników pochodzących od gospodarza w tworzeniu biofilmu.
Po wzroście usuń podłoże z komor i delikatnie przepłucz każdą komorę dwa razy 300 mikrolitrami sterylnego PBS.
Następnie, aby przygotować mieszankę barwiącą biofilm, dodaj 1 mikrolitr każdego barwnika z zestawu żywotności do każdego mililitra potrzebnego roztworu i wymieszaj roztwór.
Optymalna ilość barwnika i czas barwienia ustala się empirycznie dla każdego organizmu.
Dodaj 200 mikrolitrów mieszaniny barwiącej do każdej jamki komorowego szkła pokrywowego. Inkubuj szkło pokrywowe.
Po inkubacji usuń mieszankę barwiącą z komór i przepłucz każdą jamkę 300 mikrolitrami sterylnego PBS.
Zamień PBS na świeże media. Na koniec przejdź do wizualizacji za pomocą mikroskopii konfokalnej.