Aktywacja światłem biofilmów bakteryjnych z użyciem prekursora fotosensywnego

Zacznijmy od mikropłyt zawierających biofilmy patogennej bakterii, podzielonych na cztery grupy eksperymentalne.

Delikatnie aspiruj podłoże i spłuknij buforem, aby usunąć nieprzywierające komórki.

Dodaj bufor zawierający prekursor fotosensydenta do dwóch grup, podczas gdy pozostałe dwie otrzymują bufor samodzielnie.

Inkubuj wszystkie grupy w ciemności, aby prekursor mógł przeniknąć przez biofilm, wejść do komórek bakteryjnych i zostać zmetabolizowanym do fotosensyzatora, który gromadzi się w cytoplazmie i błonach.

Po inkubacji naświetl światło jedną grupę impregnowaną prekursorem i jedną grupę tylko buforową.

W grupie traktowanej prekursorem światło pobudza fotosensyzatora, który przekazuje energię tlenowi cząsteczkowemu i wytwarza reaktywne składniki tlenu (ROS).

ROS rozbijają błony, rozkładają białka i fragmentują DNA, co prowadzi do śmierci komórek bakteryjnych.

Pozostałe trzy warunki nie generują ROS, ponieważ albo prekursor, albo światło jest nieobecne, pozostawiając biofilm nienaruszony.

Aby wygenerować biofilm w płytce o pojemności 96 dołków, najpierw zainokuluj rozmrożoną Staphylococcus aureus USA w temperaturze 1 minus 80 stopni Celsjusza trzysta w trzech biofilmach, tworząc kliniczne kultury szczepowe w pojedynczych 14-mililitrowych probówkach z okrągłym dnem zawierających pięć mililitrów bulionu tryptonowego sojowego, czyli TSB, w inkubatorze 37 stopni Celsjusza i potrząsając przez noc. Gdy hodowle osiągną fazę stacjonarną, odwiruj komórki bakteryjne i ponownie zawiesij granulki oraz PBS do stężenia 2 razy 10 do dziewiątej kolonii na stężenie mililitra. Rozcieńcz te zawiesiny bakteryjne w proporcji 1 do 200 i podłożu TSB uzupełnionym glukozą 0,5% oraz nasiew 200 mikrolitrów komórek bakteryjnych na odwiert w trzech dołkach na szczep na grupę eksperymentalną w hodowli polistyrenowej mikropłyty obtraktowanej 96 dołków na 24-godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z użyciem tlenu, Bez drżenia.

Następnego dnia delikatnie umyj studnie trzy razy PBS, nie naruszając biofilmów. Następnie dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego ALA do odpowiednich studni eksperymentalnych i umieść płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza na godzinę chronioną przed światłem. Następnie naświetlaj płytę diodą emitującą światło o natężeniu światła 100 miliwatów na centymetr kwadratowy przez godzinę.