JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 3:15 min • March 31st, 2026
Zacznij od dużej szklanej szkiełki, a mniejsze szklane szkiełki umieszczone na obu krawędziach w podwójnej warstwie.
Wlej stopioną agarozę do przestrzeni i przykryj kolejną dużą szklaną szkiełką.
Zrelaksuj ustawienie, żeby wzmocnić agarozę.
Usuń szkiełka i pokrój agarozę na małe podkładki.
Umieść agarozowe pady w klejowej ramce przymocowanej do suwaka.
Weź hodowlę bakterii patogennych, genetycznie zmodyfikowanych, aby wyrazić fluorescencyjnie oznakowany system wydzielania niezbędny do zakażenia gospodarza.
Użyj gęstego plastra bakteryjnego i zawiesz go w wodzie.
Wir, aby równomiernie rozpraszać bakterie.
Nałóż zawiesinę na poduszkę agarozową, aby unieruchomić bakterie.
Uszczelnij za pomocą pokrywki, aby utrzymać nawodnienie.
W oświetleniu jasnym polem wybierz pole komórek do obrazowania.
Optymalizuj ustawienia mikroskopu, aby ograniczyć wybielanie i zwiększyć czułość sygnału.
Przełącz się na kanał fluorescencyjny, aby wykryć bakterie oznaczone fluorescencją.
Zacznij od wykonania agarozowych podkładów do obrazowania żywych komórek. Przygotuj około 30 mililitrów roztworu agarozy o niskim stopniu o niskim stężeniu w wodzie i podgrzej w mikrofalówce w szklanej kolbie przez około 90 sekund, od czasu do czasu mieszając ją, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
Umieść dwa szklane szkiełka o wymiarach 22 na 22 na 0,15 milimetra na krawędzi szkiełka o wymiarach 25 na 75 na 1,1 milimetra, jeden na drugim. Następnie ułóż dwa mniejsze wysuwki na drugiej krawędzi. Pipetą włóż około 1 mililitra stopionej agarozy do środka między dwoma górnymi szkiełkami i umieść kolejną dużą szkiełkę na stopionej agarozie, upewniając się, że nie powstają pęcherzyki powietrza.
Schłodź szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie użyj skalpela lub żyletki, aby delikatnie pokroić podkładkę na małe kwadraty. Przymocuj dwustronną ramę klejącą na szklanym szkiełku o wymiarach 25 na 75 na 1,1 milimetra i umieść kilka padów na zamku. Rozpuść gęstą warstwę Legionella pneumophila w 1 mililitrze podwójnie destylowanej wody.
Następnie zacznij wirować i pipetować 2 do 3 mikrolitrów rozcieńczenia na podkładki. Delikatnie załóż na ramkę okładkę o wymiarach 58 na 24 na 0,15 milimetra. Wybierz komórki do obrazowania przy użyciu jasnego oświetlenia polowego.
Następnie w oknie przechwytywania oprogramowania mikroskopu dostosuj ND do 180 stopni, a binning do 2 na 2. Użyj kanału o średnicy 488 nanometrów, aby naświetlić próbkę przez 500 do 1000 milisekund i zweryfikować specyficzność fluorescencji, obrazując nieoznakowaną Legionella pneumophila o tych samych parametrach.