Name: Połączenie barwnika lipofilowego, hybrydyzacji in situ, immunohistochemii i histologii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Poznaj połączenie barwnika lipofilowego, hybrydyzacji in situ, immunohistochemii i histologii do analizy tkanki mysiej. Ta metoda pozwala skorelować mutacje genetyczne z profilem morfologicznym i ekspresji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Obrazy konfokalne uzyskano w University of Iowa Carver Center for Imaging. Finansowanie zostało zapewnione przez grant SBIR (MH079805) dla B.F. Dodatkowe wsparcie w zakresie hodowli myszy na potrzeby tego projektu zostało zapewnione przez NIDCD (5R01DC00559007) dla B.F.

<ol><li>Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+three-color+neuronal+tracing+in+fixed+tissue+using+NeuroVue+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes.</a> Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).</li>
<li>Tonniges, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-+and+bio-physical+characterization+of+novel+violet+and+near-infrared+lipophilic+fluorophores+for+neuronal+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing.</a> Journal of Microscopy. , (2010).</li>
<li>Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+tracing+with+DiI%3A+decalcification%2C+cryosectioning%2C+and+photoconversion+for+light+and+electron+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis.</a> J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).</li>
<li>Gurung, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+embryonic+midbrain+thalamic+and+thalamic+auditory+connection+development+in+mice+as+revealed+by+carbocyannine+dye+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection.</a> J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).</li>
<li>Fritzsch, B., Nichols, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI+reveals+a+prenatal+arrival+of+efferents+at+the+differentiating+otocyst+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice.</a> Hear Res. 65, 51-60 (1993).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+suppresses+hair+cell+differentiation+in+ear+ganglia+and+regulates+hair+cell+subtype+development+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea.</a> PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).</li>
</ol>

Tkanki mysie pobrano zgodnie z wytycznymi i regulacjami określonymi przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Instytucjonalnych Uniwersytetu Iowa (ACURF 0804066).

W niniejszym filmie prezentujemy metodę łączącą cztery techniki w celu maksymalizacji zakresu zbieranych danych oraz ich spójności poprzez korelację danych w obrębie danego zwierzęcia (rycina 3). Podejście to pozwoli ograniczyć liczbę zwierząt hodowlanych, a tym samym skrócić czas potrzebny na uzyskanie danych nadających się do publikacji, przy jednoczesnym zwiększeniu ilości informacji na temat kolokalizacji i efektów korelacyjnych mutantów. Choć w filmie wykorzystano embriony myszy, za pomocą tych technik można analizować również dorosłe myszy, jak i inne zwierzęta, takie jak kurczaki, Xenopus oraz zebrafish. W przypadku stosowania innych gatunków może być konieczna modyfikacja trawienia proteinazą K. W tym protokole używamy różnych fluorescencyjnych barwników NeuroVue do specyficznego znakowania do trzech wybranych populacji neuronów. Zaletą tych barwników jest możliwość ich stosowania u myszy mutantów, co może być problematyczne w przypadku polegania wyłącznie na immunohistochemii, która może lub nie może być wpływana przez analizowane mutacje; dodatkowo barwniki te znakują neurony w sposób retrogradny i anterogradny. 5Niedawne badanie pozwoliło również zwiększyć liczbę populacji neuronów, które można znakować jednocześnie, do sześciu. 2Następnie barwnik lipofilowy, znakujący tę samą badaną tkankę, może zostać poddany analizie przy użyciu in situ hybrydyzacja, służąca do analizy transkrypcji genów, która może być następnie analizowana za pomocą immunohistochemii w celu określenia rozkładu białek. Tę drugą analizę można uzupełnić szczegółową histologią, która może przyczynić się do charakterystyki fenotypu 6Ta wieloczynnikowa analiza stwarza możliwość uzyskania nowych spostrzeżeń dzięki analizie korelacyjnej przeprowadzanej w obrębie tego samego zwierzęcia, co w przeciwnym razie mogłoby być mało prawdopodobne lub wymagało zastosowania bardziej rozbudowanych protokołów oraz hodowli myszy.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; Hybrydyzacja:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>zestaw buforów do płukania i blokowania PC DIG</td><td>Grupa Roche</td><td>1585762</td><td></td></tr><tr><td>Bufor 20x SSC (premix)</td><td>Grupa Roche</td><td>1666681</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>piroseczczan dwuetylowy (DEPC) </td><td>Research Products International Corp.</td><td>D43060</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu</td><td>Research Products International Corp.</td><td>D20020</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple </td><td>Grupa Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Fragmenty Fab anty-Dig-AP</td><td>Grupa Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>enzym RNaza A 10 mg/ml</td><td>Fermentas</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Research Products International Corp.</td><td>7003</td><td></td></tr><tr><td>DNA nasienia łososia 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca Stericup 0,22 µm&amp;mu;m; 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>dyski filtrujące 0,2 μm&amp;mu;m; 25 mm</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>saszetki z fosforanem buforem solnym pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Immunohistochemia:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;barwnik Crystal Violet</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>9460</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Histologia:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Poly/Bed 812 Embedding Media/DMP-30 </td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08792-1</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek propylenu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110205</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór glutaraldehydu 50%</td><td>Fisher Scientific</td><td>G151</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe DPX</td><td>Fluka</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>Kołysarka</td><td>MidSci</td><td>55D1114</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-715-125D</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator ustawiony na 60°C&amp;#x00B0;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Śledzenie barwnikiem:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyce</td><td>Geuder</td><td>G-19775</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna pęseta</td><td>E.M.S</td><td>72680-F</td><td></td></tr><tr><td>Barwniki NeuroVue: bordowy, czerwony, jadeitowy</td><td>MTTI</td><td>FS-100(1,2,6)</td><td></td></tr><tr><td>1X roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>Zakres sekcji</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator ustawiony na 36&amp;#x00B0;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-506DQ</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica Microsystems</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Slajdy</td><td>Surgipath</td><td>00240</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Surgipath</td><td>00106</td><td></td></tr><tr><td>RPI</td><td>Glicerol</td><td>G22025-0.5</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (4% i 0,4%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr></tbody></table>

Łączenie barwnika lipofilowego, hybrydyzacji in situ, immunohistochemii i histologii

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Wyjście poza analizę funkcji pojedynczego genu w celu głębszego zbadania sieci regulacji genów wymaga połączenia wielu mutacji w jednym zwierzęciu. Taka analiza dwóch lub więcej genów musi być uzupełniona hybrydyzacją in situ innych genów lub immunohistochemią ich białek, zarówno w całych preparatach rozwijających się organów, jak i w ich przekrojach, aby uzyskać szczegółową rozdzielczość zmian w ekspresji komórkowej i tkankowej. Łączenie wielu zmian genetycznych wymaga zastosowania kreazy lub flipazy do kondycjonalnego usuwania genów w celu uniknięcia letalności zarodkowej. Wymagane schematy krzyżowania drastycznie zwiększają nakład pracy i koszty proporcjonalnie do liczby zmutowanych genów, co skutkuje uzyskaniem bardzo niewielu zwierząt z pełnym zestawem pożądanych modyfikacji genetycznych. Amortyzacja ogromnego nakładu pracy i czasu potrzebnego na pozyskanie tych kilku cennych osobników z wieloma mutacjami wymaga optymalizacji wykorzystania tkanek. Co więcej, badanie jednego zwierzęcia za pomocą wielu technik ułatwia korelację defektów wynikających z delecji genów z profilami ekspresji. Opracowaliśmy technikę pozwalającą na przeprowadzenie bardziej szczegółowej analizy danego zwierzęcia, umożliwiającą badanie kilku różnych, rozpoznawalnych histologicznie struktur, a także ekspresję genów i białek z jednego okazu, zarówno w całych organach, jak i w ich przekrojach. Chociaż do wykazania skuteczności tej techniki wykorzystano myszy, można ją zastosować w szerokim zakresie gatunków zwierząt. W tym celu łączymy śledzenie za pomocą barwników lipofilnych, hybrydyzację in situ w całych preparatach, immunohistochemię oraz histologię, aby wydobyć maksymalną możliwą ilość danych.

Przedstawiono kombinację różnych technik w celu maksymalizacji zakresu gromadzonych danych z tkanki mysiej.

Wyjście poza analizę funkcji pojedynczego genu w celu głębszego zbadania sieci regulacji genów wymaga wprowadzenia wielu mutacji jednocześnie w jednym organizmie. Taka analiza...

Wyjście poza analizę funkcji pojedynczego genu i badanie sieci regulacji genów wymaga wprowadzenia wielu mutacji u jednego osobnika. W tym systemie optymalizujemy ilość danych pozyskiwanych z jednej tkanki, aby skorelować mutacje genetyczne z profilami morfologicznymi i ekspresyjnymi. Osiąga się to poprzez wstępne wstrzyknięcie lipofilowego barwnika w celu wizualizacji kilku odrębnych populacji neuronalnych.Hybrydyzację in situ przeprowadza się w celu wizualizacji czasowo-przestrzennego wzorca transkrypcji genów. Podczas gdy immunohistochemia odzwierciedla specyficzne wzorce ekspresji białek, dodatkowy wymiar cięcia histologicznego przyczynia się do charakterystyki fenotypu. Ten układ eksperymentalny umożliwia analizę kilku różnych struktur rozpoznawalnych histologicznie, a także ekspresji genów i białek, wszystko to z tej samej próbki, zarówno w preparatach całych, jak i w przekrojach, stanowiąc system łączący śledzenie za pomocą barwników lipofilnych, hybrydyzację in situ, immunohistochemię oraz histologię.Technika ta maksymalizuje ilość informacji uzyskiw ownych z pojedynczego preparatu, korelując morfologię z ekspresją genów i białek. Podczas wszystkich sekcji i manipulacji tkankowych, utrwal zwierzęta w 4%paraldehyde w 0,1 molarnym buforze fosforanowym poprzez perfuzję przezsercową z użyciem pomp perystaltycznych z igłami o odpowiedniej wielkości. Ze względu na światłoczułość DY, należy przechowywać je w ciemnej, zamkniętej komorze, a aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych, wyznaczyć oddzielny zestaw narzędzi do obsługi każdego barwnika pod mikroskopem stereoskopowym.Należy wyznaczyć miejsce aplikacji barwnika, aby selektywnie oznakować rozważaną populację neuronów, a nie inne zbędne struktury. Usunąć zbędną tkankę w celu wizualnego potwierdzenia wybranego miejsca oraz uzyskania dostępu do miejsca aplikacji barwnika. Następnie należy pociąć przygotowane paski filtra barwnika neuro view na odpowiedniej wielkości trójkątne kawałki za pomocą mikronożyczek.Należy odciąć jak najmniejszy fragment, aby uniknąć znakowania innych struktur podczas wprowadzania do tkanek miękkich, takich jak bezpośrednio mózg. Filtr należy wprowadzić, wykorzystując wierzchołek trójkąta filtra do przebicia tkanki. W przypadku tkanek bardziej sztywnych należy wykonać nacięcie, aby ułatwić wprowadzenie filtra. Nie należy używać igły sekcyjnej do wpychania filtra w tkankę.Umieść preparaty w szczelnie zamkniętej fiolce z 4% paraformaldehydem i inkubuj w temperaturze 36 stopni Celsjusza w ciemności od 2 do 14 dni, w zależności od wieku oraz odległości dyfuzji do pokonania. Używając stereomikroskopu z epifluorescencją, sprawdź, czy barwnik dyfundował do pożądanego miejsca, a następnie wypreparuj interesującą tkankę. Zamocuj preparat na szkiełku za pomocą glicerolu w celu obrazowania przy użyciu mikroskopu konfokalnego.Po obrazowaniu lipofilnych oczu za pomocą konfokalu, przenieś próbki do probówki typu Eppendorf o pojemności 2 ml wolnej od RNaz, zawierającej PBS wolny od RNaz, aby systematycznie wypłukać glicerol. Przetraktuj próbki w procesie odwodnienia i nawodnienia, stosując szereg stężeń metanolu w temperaturze 4 °C. Rozpocznij od inkubacji w 100% metanolu przez co najmniej godzinę, a następnie stopniowo zmniejszaj stężenie aż do 25% metanolu przez 15 minut.Przemyć trzy razy w 1x PBS przez pięć minut każde z prań. Przetrawić tkankę, dodając 2 µL proteinazy K o stężeniu 20 mg/mL do 2 mL świeżego PBS. Monitorować reakcję trawienia, obserwując zmianę stopnia mętności tkanki z nieprzezroczystej na niemal przejrzystą.Aby zatrzymać trawienie enzymatyczne, inkubuj próbki w 4% paraformaldehydzie przez pięć minut. Następnie przemyj je raz w PBS przez jedną minutę, a potem wykonaj trzy kolejne płukania po pięć minut. Wylej ostatnią porcję PBS, dbając o jak najdokładniejsze usunięcie cieczy jako etap poprzedzający hybrydyzację.Inkubować próbki w 1,8 ml buforu do hybrydyzacji. Mieszać przez jedną godzinę w temperaturze 60 °C na mieszalniku obrotowym. Zdenaturować DNA sperm salmonella poprzez inkubację w temperaturze 85 °C przez 10 minut, a następnie umieścić na lodzie. Do każdej próbki dodać 200 µl zdenaturowanego, jednoniciowego DNA oraz około 100 ng sondy riba znakowanej DIG. Hybrydyzować przez noc w temperaturze 60 °C w piecu do hybrydyzacji.Próbki należy poddać trzem 10-minutowym przemywaniom w 2×SSC w temperaturze 60°C w piecu do hybrydyzacji. Co ważne, należy usunąć wszelką endogenną aktywność fosfatazy alkalicznej poprzez przemywanie w 2×SSC przez 60 minut w temperaturze 70°C w bloku grzewczym ISO temp. Następnie próbki należy przemyć w PBS przez pięć minut.Następnie należy zastąpić PBS, dodając 1 µL roztworu RNA A o stężeniu 10 mg/mL, i inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym ISO temp. Po odpiersieniu roztworu PBS z RNA A, próbkę należy przemyć trzykrotnie w roztworze piorącym, po 10 minut każdorazowo.Na koniec należy podgrzać i aktywować pozostałe RNA poprzez inkubację przez 60 minut w temperaturze 70°C w bloku grzejnym z termostatem ISO. Ostatnim krokiem jest wizualizacja sondy rybo. Próbki należy inkubować w jednokrotnym buforze blokującym przez jedną godzinę.Odlej bufor blokujący i dodaj do każdej próbki dwa mililitry buforu blokującego zawierającego jeden mikrolitr przeciwciała anty-ditch. Inkubuj przez noc, a następnie przemyj kilka razy 1× buforem do mycia zgodnie z instrukcją. Następnie inkubuj próbki w 1× buforze do mycia przez noc.Przelej próbki buforem do detekcji jeden raz przez 10 minut, a następnie przenieś próbki na płytkę mikrotitracyjną. Odlej bufor i przeprowadź reakcję barwną z użyciem BM purple, ponieważ BM.Purple jest światłoczuły. Po uzyskaniu pożądanej siły sygnału przykryj płytkę folią lub pudełkiem.Przepłucz próbki w dołkach buforem detekcyjnym przez pięć minut. Wykonaj obrazowanie próbek za pomocą mikroskopii transmisyjnej lub przechowuj je w 4% Paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W razie potrzeby usuń z tkanki barwniki lipofilowe, stosując szereg stężeń etanolu.Następnie rehydratyzuj tkankę, stopniowo dodając PBS przez okres od pięciu do 10 minut. Teraz zablokuj tkankę przez jedną godzinę w 2,5% normalnym surowicy koziej i 0,5% Triton X 100 w temperaturze pokojowej na wytrząsarce; inkubuj z przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym w roztworze blokującym przez 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsius na wytrząsarce; przemyj trzy razy PBS, po jednej godzinie każdego procesu. Ponownie zablokuj próbki, a następnie inkubuj z fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem wtórnym rozcieńczonym w roztworze blokującym przez 12 do 24 godzin w temperaturze czterech stopni Celsius na wytrząsarce. Od tego momentu należy zadbać o ochronę próbek przed światłem, ponieważ przeciwciała wtórne są światłoczułe.Ponownie przemyj próbki trzy razy w PBS, po jednej godzinie każdego płukania. Na koniec przeanalizuj preparaty za pomocą obrazowania z wykorzystaniem mikroskopii epifluorescencyjnej i konfokalnej. Osadzanie w żywicy epoksydowej i krojenie wymaga utrwalenia tkanki w 2,5% GLUTARALDEHYDE 1% PFA w 0,1 molarnym buforze fosforanowym, zazwyczaj przez noc w szklanej fiolce z próbką; odwodnij tkankę poprzez inkubacje w roztworach etanolu o stopniowanym stężeniu, aby przejść do rozpuszczalników, inkubując w mieszaninie etanolu absolutnego i tlenku propylenu w stosunku 1:1 przez pięć minut, a następnie wykonując pięć 10-minutowych płukań w samym tlenku propylenu; przeprowadź infiltrację próbki żywicą poprzez prostą inkubację w mieszaninie tlenku propylenu i żywicy w stosunku 1:1 przez noc na wytrząsarce.Przelej roztwór z próbką do płaskiej formy do zatapiania i pozostaw na blacie na cztery do sześciu godzin w celu odparowania tlenku propylenu. Przenieś próbki do 100% żywicy na cztery godziny do końcowej formy. Zatop próbki w żywicy i umieść etykietę.Pozostawić żywicę do polimeryzacji, inkubując ją w temperaturze 60 °C przez 24 do 48 godzin. Aby zminimalizować ilość nadmiarowej żywicy, w razie potrzeby przyciąć blok żywicy żyletką. Na ultramikrotomie.Przygotować seryjne skrawki o grubości od jednego do dwóch mikronów, zamontować i obrazować próbki za pomocą mikroskopii transmisyjnej oraz epifluorescencyjnej. Barwniki lipofilowe o różnych długościach fali mogą ułatwić wizualizację projekcji centralnych trzech różnych nerwów czaszkowych. W tym przypadku barwnik lipofilowy zostaje wprowadzony do części obwodowych nerwu trójdzielnego, językowo-gardłowego oraz błędnego.Po inkubacji w celu dyfuzji barwnika, centralne wypustki nerwów prowadzące do pnia mózgu są wizualizowane za pomocą mikroskopii w polu jasnym. Po wycięciu i płaskim zamontowaniu tylnego mózgu, wyraźnie widoczne jest znakowanie centralnych wypustek trzech znakowanych nerwów. W przeciwieństwie do mikroskopii w polu jasnym, mikroskop konfokalny umożliwia uzyskanie obrazu trójwymiarowego, w którym oświetlone są specyficzne obszary, a zastosowanie trzech różnych barwników pozwala na ocenę rozkładu każdej populacji.W odniesieniu do pozostałych, tutaj aferentne włókna ucha wewnętrznego zostały prześledzone u noworodka myszy za pomocą neuro view. Czerwony kolor oznacza hybrydyzację in situ dla prox1, a kombinacja immunoreaktywności przeciwko tubulinie i przeciwko prox1 służy do wizualizacji włókien aferentnych.Dodatkowo, przekrój żywicy epoksydowej o grubości dwóch mikronów obrazuje ślimaka w przekroju poprzecznym. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest staranne wybranie miejsca aplikacji preparatu lipofilowego. Dobra znajomość neuroanatomii pomoże w tym procesie; należy również zachować ostrożność podczas wszystkich etapów wrażliwych na światło.Niniejsza procedura pozwoli ograniczyć liczbę krzyżówek oraz czas potrzebny na uzyskanie danych nadających się do publikacji, jednocześnie poprawiając informacje na temat kolokalizacji i efektów wspólnych u mutantów.

combining-lipophilic-dye-situ-hybridization-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Łączenie barwnika lipofilowego, in situ hybrydyzacji, immunohistopatologii i histologii

Technika łącząca barwienie tetramerami in situ i hybrydyzację in situ (ISTH) umożliwia wizualizację, mapowanie i analizę bliskości przestrzennej wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ względem zainfekowanych wirusem komórek docelowych oraz określenie ilościowych zależności między tymi efektorami odpornościowymi a celami w kontekście wyników infekcji.

Technika jednoczesnej wizualizacji wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ i komórek zainfekowanych wirusem in situ

Źródło: Jolly, S., et.al. Połączenie podwójnej fluorescencji  hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w sekcjach mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2016). Ten film demonstruje zastosowanie hybrydyzacji in situ z podwójną fluorescencją do wizualizacji ekspresji dwóch celów RNA w sekcjach mózgu myszy. Protokół obejmuje sekwencyjne wykrywanie RNA za pomocą sond znakowanych izotiocyjanianem fluoresceiny i digoksygeniną, a następnie enzymatyczne wzmacnianie sygnału w...

 Wykonywanie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ w celu wykrycia ekspresji genów w skrawkach mózgu myszy

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Opisujemy wielozadaniową procedurę chromogenicznej hybrydyzacji in situ (MC-WISH) w nienaruszonych zarodkach Drosophila, pozwalającą na jednoczesne i specyficzne wykrywanie trzech różnych wzorców dystrybucji mRNA poprzez kontrastujące kolorowe osady.

Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila

Lokalizacja ekspresji genów w określonych typach komórek może być trudna ze względu na brak specyficznych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy protokół jednoczesnego potrójnego wykrywania ekspresji genów poprzez połączenie hybrydyzacji in situ RNA z podwójną fluorescencją z barwieniem immunologicznym.

Połączenie podwójnej fluorescencji hybrydyzacji in situ z immunoznakowaniem w celu wykrycia ekspresji trzech genów w wycinkach mózgu myszy

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Tutaj opisujemy protokół barwienia immunohistochemicznego multipleksu fluorescencyjnego i obrazowania dla jednoczesnej lokalizacji wielu antygenów związanych z rakiem w chłoniaku. Protokół ten można rozszerzyć o analizę kolokalizacji biomarkerów we wszystkich sekcjach tkanki.

Multipleksowane fluorescencyjne barwienie immunohistochemiczne, obrazowanie i analiza w próbkach histologicznych chłoniaka

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Ten protokół opisuje metodę łączenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunohistochemii fluorescencji (IHC) zarówno w świeżo mrożonych, jak i stałych sekcjach mózgu myszy, w celu uzyskania wieloznakowego sygnału FISH i fluorescencji IHC. IHC celował w białka cytoplazmatyczne i przyłączone do błony.

Połączenie hybrydyzacji fluorescencji in situ multipleksowej z immunohistochemią fluorescencyjną na świeżo zamrożonych lub utrwalonych wycinkach mózgu myszy

Ten protokół opisuje szczegółowe etapy wstępnego wdrażania mikroskopii immunoelektronowej, skupiając się na badaniu obwodów synaptycznych i lokalizacji białek w siatkówce.

Badanie obwodów siatkówki i lokalizacji molekularnej poprzez wstępne osadzenie mikroskopii immunoelektronowej

Poznaj połączenie barwnika lipofilowego, hybrydyzacji in situ, immunohistochemii i histologii do analizy tkanki mysiej. Ta metoda pozwala skorelować mutacje genetyczne z profilem morfologicznym i ekspresji.

Łączenie barwnika lipofilowego, hybrydyzacji in situ, immunohistochemii i histologii

Przeglądaj więcej filmów