Szczepienie patogena bakteryjnego do liści Arabidopsis poprzez infiltrację próżniową

Weź posiew bakteryjny zdolny do zakażenia tkanki liściowej.

Zeskrobaj kolonie i zawiesz w roztworze soli.

Zmierz gęstość optyczną, aby ocenić stężenie bakterii, a następnie rozcieńcz do pożądanego przedawkowania.

Wykonuj serialne rozcieńczenia, aby osiągnąć końcowe stężenie inokulum.

Dodaj środek powierzchniowo czynny, aby zmniejszyć napięcie powierzchniowe i zapewnić równomierne rozprzestrzenianie się bakterii na liściu.

Przenieś zawieszenie do szalki Petriego.

Następnie połóż dwa drewniane patyki na wierzchu doniczki Arabidopsis .

Odwróć roślinę na talerzu, zanurzając liście w zawiesienie.

Umieść układ w komorze próżniowej i zastosuj impuls próżniowy

Przyłożona próżnia usuwa powietrze z tkanki liścia przez naturalne otwory.

Uwalnianie próżni przywraca ciśnienie atmosferyczne, zmuszając bakterie do przebywania liści.

Powtórz impulsy, aby osiągnąć maksymalną infiltrację.

Wyjmij doniczkę. Następnie wytłucz nadmiar inokulum.

Liście Arabidopsis zainfekowane bakteriami są gotowe do dalszej analizy.

Rozpraszaj zapas glicerolu interesującego szczepu strzykawki Pseudomonas od minus 80 stopni Celsjusza do płytki LB uzupełnionej odpowiednimi antybiotykami. Inkubuj płytę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 40 do 48 godzin. Zeskrobaj biomasę bakteryjną i ponownie zawiesij ją w pięciu mililitrach chlorku magnezu o pojemności 10 milimolów.

Zmierz gęstość optyczną na 600 nanometrów i dostosuj ją do 0,1, dodając chlorek magnezu o średnicy 10 milimolowych. Wykonaj serialne rozcieńczenia w 10-milimolowym chlorku magnezu, aby uzyskać końcowe stężenie inokulum 5 razy 10 do piątej CFU na mililitr. Następnie przygotuj 200 mililitrów inokulum dla roślin Arabidopsis i 50 mililitrów dla roślin fasoli.

Przed inokulacją dodaj surfaktant Silwet L-77 do końcowego stężenia 0,02% do inokulacji fasoli i 0,01% do arabidopsi. Do infiltracji Arabidopsis umieść nad garnkiem dwa drewniane patyki tworzące X i postaw naczynie skierowane do dołu nad szalką Petriego o średnicy 14 centymetrów zawierającą 200 mililitrów inokulum. Do inokulacji liści fasoli należy włożyć rośliny i roztwór inokulum do komory próżniowej i wprowadzić liść do stożkowej wirówki o pojemności 50 mililitrów zawierającej inokulum.

Daj impuls 500 milibarów przez 30 sekund, aby przeniknąć do liści. Odcedź nadmiar roztworu inokulum kartką papieru i odłóż rośliny do odpowiadającej im komory wzrostowej.