JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:00 min. • March 31st, 2026
Zacznij od stałych, unieruchomionych i przepuszczalnych komórek cyjanobakterii przyklejonych do pokrywki.
Te komórki cyjanobakteriowe wykazują białka regulujące wzrost o niskiej ilości.
Podczas obrazowania fluorescencji w wysokiej rozdzielczości naturalne światłoczułe pigmenty w komórkach cyjanobakterii emitują fluorescencję tła.
Obniża to jakość obrazu podczas wizualizacji tych białek o niskiej obfitości.
Aby zminimalizować tę fluorescencję tła, umieść pokrywę zawierającą komórki cyjanobakterii w misce barwiącej.
Dodaj bufor blokujący zawierający białka surowiczne, aby zapobiec wiązaniu przeciwciał niespecyficznych podczas dalszego przetwarzania, oraz detergent utrzymujący przepuszczalność komórek.
Połóż miskę barwiącą na lodzie i wystaw komórki na intensywne światło ksenonowe.
Światło o wysokiej intensywności inicjuje fotowybielanie, rozkładając pigmenty światłoczułe, podczas gdy białka regulujące wzrost o niskiej obfitości pozostają niezmienione.
Warunki zimne minimalizują uszkodzenia spowodowane ciepłem i zachowują integralność komórek.
Proces ten umożliwia wyraźną wizualizację białek o niskiej obfitości, regulujących wzrost, poprzez immunodawizację podczas mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości.
Przenieś umyte pokrywki do misy do bejcowania.
Dodaj 50 mikrolitrów bufora blokującego na górę slipu. Umieść całą miskę do barwienia na lodzie, a następnie przenieś ją pod źródło światła ksenonowego na co najmniej 60 minut. Po fotobieleniu i blokowaniu użyj krawędzi ręcznika papierowego, aby usunąć bufor blokujący.