JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:36 min. • March 31st, 2026
Weź zawiesinę patogennej bakterii wyizolowanej z zakażonej rośliny.
Genom bakteryjny zawiera fuzję transkrypcyjną, w której promotor genu regulującego zjadliwość również napędza ekspresję genu fluorescencyjnego bez promotoru.
Podczas infekcji roślin aktywacja promotora wywołuje produkcję białek regulacyjnych i fluorescencyjnej.
Białko regulacyjne aktywuje geny zjadliwości, podczas gdy fluorescencja zapewnia mierzalny odczyt aktywacji zjadliwości.
Wiruj ogniwa, odrzucaj supernatant, a następnie ponownie zawiesaj, aby uzyskać skoncentrowaną zawiesinę.
Umieść kroplę na slipie i nałóż agarozową podkładkę, aby rozprzestrzenić i unieruchomić komórki.
Wykonaj obraz jasnego pola, aby zidentyfikować wszystkie komórki bakteryjne, a następnie obraz fluorescencyjny, aby wykryć fluorescencję pojedynczych komórek.
Połącz oba, aby zwizualizować różnice intensywności fluorescencji, które ujawniają subpopulacje z wysoką, niską lub żadną ekspresją genów zjadliwości.
Ta zmienność fenotypowa odzwierciedla strategię adaptacyjną, która zwiększa przeżywalność bakterii podczas kolonizacji roślin.
Do analizy pojedynczej komórki przygotuj roztwór agarozy 1,5% w wodzie destylowanej. Po stopieniu dodaj tyle objętości, by wypełnić przestrzeń między dwoma mikroskopowymi preparatami ustawionymi obok siebie i połóż kolejne szkiełko na wierzchu. Pozwól im jechać przez 15 minut i ostrożnie zdejmij zasuwkę umieszczoną na górze.
Używając ostrza, potnij agarozową podkładkę na kawałki o wymiarach 5 na 5 milimetrów przed użyciem. Równolegle wiruj 1 mililitr bakterii ekstrahowanych apoplastami. Ostrożnie usuń supernatant pipetą i ponownie zawiesz pellet w 20 mikrolitrach wody, aby skoncentrować komórki.
Umieść kroplę 2 mikrolitrów skoncentrowanych komórek na pokrywę 0,17 mm i przykryj kroplę kawałkiem agarozowej podkładki. Wizualizuj przygotowanie bakterii pod mikroskopem konfokalnym, aby zidentyfikować zielone bakterie fluorescencyjne za pomocą konkretnych laserów. Zidentyfikuj wszystkie bakterie za pomocą jasnego pola i połącz oba pola.