$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Zacznij od małych kawałków schłodzonej tkanki liściowej, w których łyk jest zainfekowany patogenem bakteryjnym.
Umieść kawałki w moździerzu z ciekłym azotem, aby zahamować aktywność nukleaz rozkładających DNA.
Miel, aby mechanicznie rozbić komórki i uwolnić składniki wewnątrzkomórkowe.
Użyj schłodzonej łopatki, aby przenieść proszek, dodać bufor lizowy i zawortować zawiesinę.
Inkubować do lizowania jąder roślin i komórek bakteryjnych, uwalniając DNA i RNA podczas denaturacji białek.
Dodaj RNazę i inkubuj, aby rozłożyć RNA.
Dodaj bufor wydzielania białek, aby zagregować białka, a następnie wiruj je, aby je rozdzielić.
Przenieś supernatant zawierający DNA roślin i bakteryjnych do izopropanolu, aby wytrącić DNA w formie nici nici.
Wirówka, aby pobrać DNA i usunąć supernatant.
Przemyj etanolem, potem wiruj i wyrzuć supernatant.
Susz DNA na powietrzu, następnie dodaj bufor rehydracyjny i inkubuj ją, aby je rozpuścić.
Próbki DNA są już gotowe do dalszego wykrywania patogenów za pomocą PCR.
Użyj czystych nożyczek, aby odciąć cały świeży liść z drzewa cytrusowego i włożyć go do czystej plastikowej torebki na kanapki. Następnie schłodzić moździerz, dodając niewielką ilość ciekłego azotu. Następnie użyj nożyczek, aby wyciąć małe kawałki tkanki liścia, około jednego cala kwadratowego.
Włóż kawałki liści do zaprawy, aby natychmiast je zamrozić. Szybko zacznij mielić tkankę liściową moździerzem, aż ciekły azot odparuje i pozostanie drobny zielony proszek. Następnie schłodzić metalową łopatkę w ciekłym azocie przez 10 do 15 sekund. Następnie użyj zimnej łopatki, aby pobrać zmieloną tkankę z moździerza w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Użyj pipety o pojemności 1000 mikrolitrów, aby dodać 600 mikrolitrów roztworu lizy jąder do próbki. Następnie zawortkuj próbkę przez jedną do trzech sekund. Inkubuj rurkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza w kąpieli wodnej przez 15 minut.
Po zakończeniu okresu inkubacji użyj pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby dodać 3 mikrolitry roztworu RNazy do lizatu, aby usunąć RNA. Następnie wymieszaj zawartość rurki, odwracając ją dwa do pięciu razy. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut w inkubatorze szafkowym. Po 15 minutach dodaj do próbki 200 mikrolitrów roztworu wytrącania białka. Uruchom rurę z dużą prędkością przez 20 sekund.
Następnie wiruj próbkę w 13000 g przez 3 minuty. W trakcie wirowania należy dodać 600 mikrolitrów izopropanolu utrzymywanego w temperaturze pokojowej do nowej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Po zakończeniu wirowania ostrożnie usuń supernatant z rurki wirówki do rurki zawierającej izopropanol. Wyrzuć granulkę.
Odwróć rurkę, aby DNA było widoczne jak nitkowata. Następnie odwiruj próbkę w 13000 g przez minutę w temperaturze pokojowej.
Przelej supernatant po wirówce. Następnie dodaj 600 mikrolitrów 70% etanolu do pelletu. Odwróć rurkę kilka razy, aby umyć granulkę. Wiruj probówkę na 13000 g przez 1 minutę. Po zakończeniu wirowania ostrożnie zasysaj supernatant. Następnie odwróć tubkę z otwartą pokrywką na chłonnym papierze, aby wyschła na powietrzu przez 15 minut. Po wyschnięciu dodaj do pelletu 100 mikrolitrów roztworu rehydratacyjnego DNA. Inkubuj zawiesinę DNA w temperaturze 65 stopni Celsjusza w kąpieli wodnej przez godzinę.