JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:54 min. • August 31st, 2026
Należy pobrać oko z modelu mysiego z zaburzoną barierą siatkówki, uprzednio wstrzykniętego wirusem adeno-zależnym niosącym gen zielonego białka fluorescencyjnego.
Zaburzona bariera siatkówkowa umożliwia przenikanie AAV do komórek fotoreceptorów, gdzie genom wirusa ulega ekspresji w celu produkcji GFP, co nadaje komórkom fluorescencję.
Przeprowadź sekcję oka, aby usunąć rogówkę i soczewkę, pozostawiając nienaruszoną gałkę oczną.
Zanurz gałkę oczną w roztworze fiksacyjnym, aby zachować strukturę siatkówki.
Przenieś oczodoły sekwencyjnie przez roztwory krioprotektanta o coraz wyższych stężeniach. Następnie inkubuj w końcowym stężeniu, aby zapobiec tworzeniu się kryształów lodu.
Zatopić oczodoł w medium do krioembeddingu i zamrozić.
Używając kriostatu, wykonaj cienkie przekroje gałki ocznej.
Przymocuj skrawki do szkiełka. Dodaj bufor zawierający detergenty w celu permeabilizacji tkanki, aby umożliwić dostęp przeciwciał podczas późniejszego barwienia immunocytochemicznego.
Opłucz przekrój. Potraktuj go roztworem blokującym, aby zapobiec nieswoistym oddziaływaniom przeciwciał podczas immunobarwienia.
Krioprzekrój siatkówki jest gotowy do dalszych procedur immunobarwienia i obrazowania fluorescencyjnego. Komórki fluorescencyjne GFP-dodatnie potwierdzają udaną transdukcję wirusową, co wskazuje na przepuszczalność siatkówki.
Po pobraniu gałek ocznych z uśpionego zwierzęcia, któremu wykonano wtryskiwanie, przeprowadź sekcję oczu w celu usunięcia soczewki i rogówki. Następnie utrwal oko metodą immersyjną w 4% paraformaldehydzie przez godzinę. Po upływie godziny przeprowadź krioprotekcję oczu w 10% sacharozy przez kolejną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie namocz oczy w 20% sacharozie przez dwadzieścia minut w temperaturze pokojowej.
Na koniec pozostaw oczy w 30% roztworze sacharozy przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia zamroź i zatop gałki oczne w żywicy do zatapiania, takiej jak cryo matrix. Następnie, używając kriostatu, wykonaj przekroje o grubości 10 µm i zamocuj je na szkiełkach przygotowanych do tkanek zamrożonych.
Następnie przeprowadź permeabilizację preparatów na szkiełkach przy użyciu detergentu przez pięć minut. Po tym wykonaj dwa krótkie przemycia w PBS. Następnie inkubuj preparaty w celu blokowania przez godzinę w temperaturze pokojowej.