Przygotowanie kriosiekcji siatkówki myszy w celu oceny przepuszczalności siatkówki dla wirusa towarzyszącego adenowirusom

Należy pobrać oko z modelu mysiego z zaburzoną barierą siatkówki, uprzednio wstrzykniętego wirusem adeno-zależnym niosącym gen zielonego białka fluorescencyjnego.

Zaburzona bariera siatkówkowa umożliwia przenikanie AAV do komórek fotoreceptorów, gdzie genom wirusa ulega ekspresji w celu produkcji GFP, co nadaje komórkom fluorescencję.

Przeprowadź sekcję oka, aby usunąć rogówkę i soczewkę, pozostawiając nienaruszoną gałkę oczną.

Zanurz gałkę oczną w roztworze fiksacyjnym, aby zachować strukturę siatkówki.

Przenieś oczodoły sekwencyjnie przez roztwory krioprotektanta o coraz wyższych stężeniach. Następnie inkubuj w końcowym stężeniu, aby zapobiec tworzeniu się kryształów lodu.

Zatopić oczodoł w medium do krioembeddingu i zamrozić.

Używając kriostatu, wykonaj cienkie przekroje gałki ocznej.

Przymocuj skrawki do szkiełka. Dodaj bufor zawierający detergenty w celu permeabilizacji tkanki, aby umożliwić dostęp przeciwciał podczas późniejszego barwienia immunocytochemicznego.

Opłucz przekrój. Potraktuj go roztworem blokującym, aby zapobiec nieswoistym oddziaływaniom przeciwciał podczas immunobarwienia.

Krioprzekrój siatkówki jest gotowy do dalszych procedur immunobarwienia i obrazowania fluorescenc