JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:24 min • August 31st, 2026
Należy rozpocząć od oka myszy transgenicznej, w które wcześniej wstrzyknięto wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV) niosącego interesujący gen kodujący białko fluorescencyjne.
Mysz ta posiada defekt genu niezbędnego do zachowania integralności wewnętrznej błony ograniczającej (ILM), która stanowi barierę oddzielającą siatkówkę od jamy ciała szklistego.
Utrata tego genu naśladuje degenerację siatkówki, co pozwala wirusowi wniknąć głębiej w warstwy komórkowe siatkówki.
Zainfekowane komórki siatkówki wykazują ekspresję badanego genu, produkując białka fluorescencyjne, co pozwala im na fluorescencję.
Następnie przeprowadź dyssekcję oka i usuń rogówkę oraz soczewkę.
Ostrożnie oddziel siatkówkę od nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE) oraz twardówki, czyli zewnętrznej warstwy oka.
Zanurzyć tkankę w utrwalaczu.
Przemyć buforem fosforanowym, aby usunąć pozostałości utrwalacza.
W obserwacji pod mikroskopem konfokalnym fluorescencja w komórkach siatkówki wskazuje na skuteczną penetrację wirusową przez uszkodzoną błonę ograniczającą wewnętrzną.
W przypadku preparatów siatkówki w układzie płaskim (flat mounts), ułatwienie sekcji uzyskaj poprzez utrwalenie wyłuskanych gałek ocznych w 4% paraformaldehydzie przez 15 do 30 minut. To utrwalenie oraz kolejne utrwalenie po sekcji muszą zostać przeprowadzone prawidłowo, ponieważ jest to kluczowe dla zachowania fluorescencji GFP. W ciągu 15 do 30 minut czasu utrwalania przeprowadź sekcję oczu, usuwając rogówkę i soczewkę.
Oddziel siatkówkę od nabłonka pigmentowego siatkówki oraz od twardówki, wykonując nacięcia wokół ora serrata i nerwu wzrokowego. Po sekcji zanurz siatkówki w 4% paraformaldehydzie na kolejne 30 minut, aby utrwalić tkankę oraz białko fluorescencyjne w transdukowanych komórkach siatkówki. Po utrwaleniu przemyj preparat przez pięć minut w sterylnym PBS o pH 7.4.