Wizualizacja poddanych obróbce termicznej kapsydów wirusowych przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Pobierz probówki zawierające kapsydy wirusowe, które są cząsteczkami wirusopodobnymi pozbawionymi materiału genetycznego.

Ogrzewaj probówki w stałej temperaturze przez różne odstępy czasu.

Krótszy czas ogrzewania powoduje łagodny stres białek kapsydu, natomiast przedłużone ogrzewanie prowadzi do rozpadu kapsydu i wywołuje agregację.

Szybko schłodź probówki, aby zapobiec dalszym zmianom strukturalnym.

Przenieś ciecz na folię parafinową.

Umieść siatkę do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) na kropli. Kapsydy przyczepiają się do powierzchni siatki.

Osusz siatkę papierem filtracyjnym, aby usunąć nadmiar cieczy.

Przemyć buforem, aby usunąć słabo przytwierdzone kapsydy, a następnie ponownie osuszyć siatkę.

Zanurz w octanie uranylu, barwniku z ciężkiego metalu, który wiąże się z powierzchnią kapsydu, sprawiając, że staje się on ciemniejszy w obrazowaniu TEM.

Osusz siatkę i umieść ją na płytce. Przechowuj płytkę w eksykatorem, aby usunąć wilgoć.

Wykonaj obrazowanie siatki przy użyciu TEM, aby zwizualizować uszkodzenia kapsydów wywołane działaniem wysokiej temperatury.

Przeprowadź obróbkę termiczną w sposób opisany wcześniej, zastępując jednak 10 mM HEPES, pH 7,4 roztworem PBS i nie rozcieńczając dalej kapsydów po obróbce. Następnie nanieś pipetą całą 15 µL kroplę roztworu poddanego obróbce termicznej na folię Parafilm. Chwyć krawędź siatki pęsetą, pozwalając jej zamknąć się na brzegu w celu przytrzymania siatki, a następnie umieść siatkę stroną z węglem do dołu na kropli poddanego obróbce roztworu.

Siatkę inkubuj przez 10 minut, aby umożliwić przytwierdzenie kapsydu do siatki. W zależności od czystości preparatu kapsydu, w razie potrzeby dodaj przemycia roztworem HEPES w postaci kropli o objętości od 10 do 15 µL, ułożonych w linii za kroplą z poddanym obróbce kapsydem. Po 10 minutach podnieś siatkę wraz z kroplą.

Umieść siatkę niemal prostopadle do kawałka papieru filtracyjnego, aby odessać kroplę. Następnie za pomocą siatki pobierz kroplę 10 do 15 µL buforu HEPES i przytrzymaj ją przez 30 sekund. Po 30 sekundach płukania odessać roztwór kolejnym kawałkiem papieru filtracyjnego.

Następnie nanieś kroplę 15 µL 2% roztworu octanu uranylu na wolny obszar folii parafinowej. Pobierz kroplę octanu uranylu za pomocą siateczki i przytrzymaj ją przez 45 s. Następnie usuń nadmiar octanu uranylu za pomocą papieru filtracyjnego, dbając o usunięcie większości roztworu.

Umieść siateczkę stroną węglową do góry na kawałku papieru filtracyjnego, uważając, aby siateczka nie przywarła do wilgoci na pęsetach. Następnie umieść papier filtracyjny z siateczką w otwartej szklanej płytce Petriego. Po powtórzeniu tego procesu dla wszystkich wariantów traktowania, umieść połówki płytek Petriego z siateczkami w eksykatorze na noc w celu wysuszenia przed obserwacją za pomocą TEM.